菠萝蛋白酶检测方法

A. 在菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定中,用硫酸铵盐析为什么要选择0%~30%的饱和度

那是因为在这个饱和度时这个蛋白酶可以沉淀析出,不同的蛋白在不同的饱和度时才能析出,这个饱和度下其他蛋白还是溶解状态,利于分离目的蛋白.

B. 菠萝蛋白酶的修饰是怎样的呢

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
目的要求
1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。2、学习酶活力测定的方法。
3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。
4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。
5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。
二、实验原理
1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。
2、 以陶瓷层析结合超滤法纯化菠萝蛋白酶，吸附材料化学性质好，可用于柱层析。
3、温度恒定时,菠萝中菠萝蛋白的热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t,失活半寿期是常数，可以用作衡公菠萝蛋白酶热稳定性的指标。
本实验应用动力学方法，以菠萝蛋白酶的热失活半衰期为热稳定性的指标，定量研究了梭酸盐和Ca2+,Zn2+士对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响，以期找到一种高效、可行的增强菠萝蛋白酶热稳定性的方法。
4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。聚乙二醇(PEG) 为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。
实验材料
试剂和材料
1、新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白
2、柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂
3、Brolain试剂、牛血清白蛋白、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯。
（二）实验仪器
1、榨汁机；
2、离心机；
3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；
4、恒温水浴锅（37℃）；
5、试管、试管架；
6、烧杯、容量瓶；
7、移液管；
四、试验方法
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶
操作步骤：
将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用
菠萝蛋白酶活力的测定
1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；
2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；
3、另取5支试管，分别对应标号1、2、3、4、5，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；
4、将10支试管置于37℃水浴；
5、然后按下表操作
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8
标准酪蛋白
（0.1mg/mL） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0
待测酶蛋白
（mL） 0 0 0 0 0 0 0 1.0
磷酸缓冲液
（mL） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
考马斯亮蓝
（mL） 4 4 4 4 4 4 4 4
通过测定不同试管中菠萝蛋白酶的吸光度A的值，进而确定酶活力的大小。
（三）聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰
1.1修饰酶的制备
60gPEG6000溶于400mL干燥吡啶,加入1.01g琥珀酸酐后60℃保温2h,然后在60℃减压蒸馏除去溶剂。加入苯直至残余物溶解,再加100mL冷己烷,4℃振荡2h过滤,残渣溶于蒸馏水后透析。PEG活性酯和菠萝蛋白酶按摩尔比50：1投料,加入到0.1molPL柠檬酸盐缓冲液中,4℃反应4h。产物在pH4.6的柠檬酸缓冲液中透析,冻干后得到白色的PEG-菠萝蛋白酶(修饰酶)。
1.2 TNBS法测定修饰率
取1mL蛋白酶溶液(1mgPmL),加入1mL4 %的碳酸氢钠溶液,1mL10%的十二烷基磺酸钠溶液,20min 后加入1mL0.1%的TNBS 溶液,40℃保温2h ,用0.5mL 1mol/L的盐酸终止反应。325nm测光吸收值。同样浓度蛋白酶溶液在修饰后与修饰前的光吸收值之比即为残留氨基率。修饰率=1-残留氨基率
（四）某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性
1.1 菠萝蛋白酶热稳定性实验方法
新鲜菠萝榨汁100mL加人到55℃预保温的一定浓度梭酸盐溶液中，不同保温时间测定菠萝蛋白酶活力，按热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t方法求出菠萝蛋白酶的半衰期。
1.2 有机羧酸盐对菠萝蛋白酶热稳定性的影响。
pH7.0时草酸钠对菠萝蛋白酶有明显稳定作用，100 mmol/l草酸钠使tl/2延长6倍，丁二酸、酒石酸甲钠也有一定的保护作用。醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠都有一定程度的保护作用，且浓度变化对保护作用的影响不大。
结果与讨论
1、修饰率的测定
测定结果按下式进行计算:修饰率= 1 - 残留氨基率= 1
- 修饰后的光吸收值P修饰前的光吸收值= 1 - 0. 502P0. 887 =
0. 4340 = 43. 40 %
2、菠萝蛋白酶在提取分离和干燥过程中，酶的活性中心巯基易被氧化而使酶活性降低。在提取过程中适当加入某些抗氧化剂，对阻止酶被氧化失活有良好作用。作为菠萝蛋白酶活性保护剂，硫代硫酸钠与半胱氨酸组合使用，可获较好的效果。
3、维系酶分子三维构象的作用力包括:氢键、疏水相互作用、静电相互作用、范德华力，有些还包括共价二硫键，蛋白质分子不管是变性、还是增强稳定性，都是通过影响这些作用力来实现的。但总的来看，氢键、疏水相互作用在增强酶的稳定性方面起着主要作用。
4、本实验通过用琥珀酸酐法活化后的PEG修饰菠萝蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量,并对其生化性质与混合酶和天然酶进行了对比研究。所得到的修饰酶在对温度和pH值的稳定性上均比天然酶有一定程度的提高，这说明PEG分子对酶有一定的保护作用,推测这种作用应来自分子间的作用力。
参考文献:
1、赵武岭,吴玮,李藏铭,等. 果实菠萝蛋白酶的动力学研究[J ] . 中国
农业大学学报,1999 ,4(1) :11 - 13.
2、章佩芬,郭勇,罗焕敏. 菠萝蛋白酶的研究与应用进展[J ] . 华西药学
杂志,2002 ,17(2) :128 - 129.
3母敬郁,麦荫乔,李小梅,等. 甲基化聚乙二醇(5000) 修饰超氢化物
歧化酶的研究[J ] . J. N. Bethuneuniv. Med. ,SCL ,1995 ,2 (12) .
4、梁楚泗,李树瑜,杨政蓓. 毛花猕猴桃蛋白酶的提纯和性质[J ] . 植物
资源与环境,1999 ,8(3) :1 - 6.

（五）结果讨论
从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：
1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；
2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；
3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；
4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；
5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。

C. 菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

你所要的文章，中国知网的相关文献有如下：
（菠萝果浸提液中菠萝蛋白酶的稳定性研究 ，影响菠萝蛋白酶活力因素的研究进展 ，
聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰 ，TiO_2吸附及超滤法部分纯化果菠萝蛋白酶的研究
Ca2+对菠萝蛋白酶热稳定性和二级结构的影响 ，不同添加物对菠萝蛋白酶酶活稳定性和抑制作用的影响 ，菠萝蛋白酶的保存稳定性研究 ，菠萝蛋白酶的提取和分离 ，提取菠萝蛋白酶工艺的研究 ，盐法提取菠萝蛋白酶的研究 ，超滤浓缩提取菠萝蛋白酶的研究 ，菠萝中蛋白酶的提取研究 。）
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D. 果菠萝蛋白酶含量的计算

菠萝蛋白酶提取，纯化与活性鉴定过程中所用缓冲液ph值不同，蔗糖酶的提取及初提纯试验中影响酶得率得因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度、抑制剂、激活剂等。

菠萝中所含的糖、酶有一定的利尿作用，对肾炎和高血压者有益，对支气管炎也有辅助疗效。由于纤维素的作用，对便秘治疗也有一定的疗效。当出现消化不良时，吃点菠萝能开胃顺气，解油腻，能起到助消化的作用，还可以缓解便秘。

生产方法

取新鲜干净的菠萝皮、刺、芯等出汁率达45%以上的下脚料，压榨，取汁滤除果屑。滤液添加0.025-0.05%的苯甲酸，加5%高岭土进行吸附。将高岭土吸附物用饱和碳酸钠溶液调pH6.7-7.0后，加5%氯化钠，搅拌后压滤。取滤液用盐酸调pH4.8-5.1，加硫酸铵，静置沉淀，取沉淀减压干燥，即为菠萝蛋白酶。对菠萝下脚料计，收率0.054-0.103%。

E. 在菠萝蛋白酶活力测定中，氢氧化钠为什么能终止酶反应 具体是怎么作用的，改变PH使没失活吗

强酸和强碱还有重金属都能使蛋白酶失去活性，不可逆的过程。氢氧化钠是强碱，所以破坏了酶活性所以终止反应

F. 目前蛋白质的精确定量检测方法都有哪些

蛋白质鉴定是指对复配类蛋白品通过前处理提纯并通过生物质谱鉴定蛋白种类及含量（包括具体的分子量、定性、定量结果）或对纯蛋白品通过生物质谱鉴定具体的蛋白类型（包括具体的分子量、定性、定量结果）。
蛋白质种类鉴定业务范围：

水溶性蛋白、水解酶、蛋白酶、脂肪酶； 血清蛋白（白蛋白和球蛋白）、牛血清（白）蛋白、血清球蛋白； 乳清蛋白、复合蛋白质、乳清蛋白粉、β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，免疫球蛋白，乳铁蛋白； 大豆分离蛋白、小麦蛋白（谷朊粉）、酪蛋白、纤维素酶、β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、糖化酶； 碱性蛋白酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸水解酶、脂肪酶、过氧化氢酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶、弹性蛋白酶。 动物饲料，大米，油料种子、谷类食品、谷类，大豆、玉米、鱼肉、果汁等各种食物中蛋白种类及含量。

G. 菠萝蛋白酶提取，纯化与活性鉴定过程中所用缓冲液ph值不同，为什么

菠萝蛋白酶提取，纯化与活性鉴定过程中所用缓冲液ph值不同
蔗糖酶的提取及初提纯试验中影响酶得率得因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度、抑制剂、激活剂等。

实验原理：
蔗糖酶分离提纯原理： 酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理： 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理： 本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。
主要实验器材：
1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5.离心机；6. 721- 型分光光度计；7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置；9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。

H. 什么是菠萝蛋白酶

是一种蛋白质水解酶（异性蛋白）。提炼出来以后有很强的分解纤维蛋白和血凝块的作用，所以在医疗上有用。菠萝中的少量菠萝蛋白酶吃到胃里后就被胃液分解破坏。但是有少数人对这种酶有过敏反应。吃后15分钟到1小时左右出现剧烈腹痛、恶心、呕吐、腹泻，四肢潮红、荨麻疹，头痛、头晕、口舌发麻等症状。严重的还会发生呼吸困难、神志模糊、休克，危及生命。 因此，鲜菠萝最好不要直接食用，安全的方法是将菠萝切块，然后浸在盐水中半小时后食用。这样一来可去除以上三种危险物质，二来增加口感，酸酸甜甜的更加爽口哟，不妨一试。

I. 菠萝蛋白酶的提取

菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。其外观为浅灰色粉末状，分子量为 33000 ，等电点为 9.55 。品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。产品已被广泛应用于食品、医药等行业。

一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用

1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中，可使面筋降解

J. SDS-PAGE测定纯化的菠萝蛋白酶分子质量实验的关键是什么

其分子量约33KD吧，我认为该实验的关键是选择合适的分离胶中丙烯酰胺的浓度，SDS-PAGE中不同浓度的胶适用于对不同大小的蛋白的电泳分离，33KD在10%-15%的胶中电泳是比较合适的，能够和marker准确比较，从而得到准确结果。
你可参考：
丙烯酰胺在凝胶中的百分比(%) 分离胶的分辨范围(KDa)
15 15-45
12.5 15-60
10 18-75
7.5 30-120
5 60-212