免疫抗体检测常用方法

① 自身抗体的检测方法有哪些

1、抗核抗体检测

抗核抗体是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称，主要是IgG，其次是IgM和IgA，无器官和种属特异性。ANA在大多数自身免疫性疾病中均可呈阳性，正常老年人也可有低滴度的ANA。ANA检测在临床自身免疫病诊断与鉴别诊断中是一个重要的筛查试验。

2、类风湿因子

类风湿因子是变性lgG刺激机体产生的一种自身抗体，主要存在于类风湿关节炎患者的血清和关节液内。主要为lgM型，也有lgG、lgA、lgD和IgE型。

3、抗中性粒细胞胞浆抗体

抗中性粒细胞胞浆抗体是指与中性粒细胞及单核细胞胞浆成分发生反应的抗体。当中性粒细胞受抗原刺激后，胞浆中的α-颗粒释放蛋白酶-3、髓过氧化物酶等物质，刺激机体而产生ANCA。

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自身抗体的产生原因：

人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、成分不发生反应。—旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为“异物”，而发生自身免疫反应，产生自身抗体。

正常人体血液中可以有低滴度的自身抗体，但不会发生疾病，但如果自身抗体的滴度超过某—水平，就可能对身体产生损伤，诱发疾病。自身免疫性疾病中有许多自身抗体，其中最重要的是抗核抗体。

② 酶联免疫检测的几种方法及其原理

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。
（2）夹心法（sandwich
assay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。
间接法（indirecr
ELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。
（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

③ 免疫学的检测方法

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫。

④ 细胞免疫功能检测常用有哪几种方法

细胞免疫（CMⅠ）是由多种细胞相互作用的结果。免疫细胞间相互作用导致多种细胞因子的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定，因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂，且很难标准化。
一、迟发型过敏反应的体外检测方法
皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。
1．皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。
2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱生接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导至DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。
二、细胞免疫的体外检测方法
体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。
1．T细胞计数
（1）E花环法：人类T细胞表面有SRBC受体（CD2）能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合，经37℃培养5～10分钟放4℃过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。目前此方法已用来分离T细胞，而不用做T细胞计数。
（2）用单克隆抗体计数T细胞：将人的PBM分成三等份，分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体作第二抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3 细胞即总T细胞。正常人在PBM中T细胞占70%～80%。正常人的CD4 细胞和CD8 细胞之和应与CD3 细胞数一致。CD4 细胞与CD8 细胞的比值正常人约为2/1而艾滋病患者则比值小于1.7。
2．T细胞活化试验 T细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法，MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲（fromazan）产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪（595mm）测量汇丰银行密度，做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数。
3．细胞毒试验 TC细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51Cr-Na2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合，于37℃培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50：1或100：1）靶细胞被杀伤越多，释放到上清液中的液游离的51Cr越多，且不能被其他细胞吸收。用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。
细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全，及经IgG介导的ADCC效应，或NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有意义的。
4．混合淋巴细胞的反应（MIR） 是体外研究T细胞的较好的方法，双向MLR常被用来筛选骨髓移植的供体。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养4～5天，在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合（靶细胞来自与刺激细胞相同的个体）如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞，可杀死活的细胞，根据靶细胞释放51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子）和LIF（白细胞移动抑制因子）来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的免疫酶技术，操作简单，并能定量以取代了MIF和LIF的测定。单个核细胞与分裂原一起培养24小时，然后测定清液中的IL-2活性。在细胞免疫功能缺损时，特别是AIDS病人，IL-2分泌明显降低。而有些疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、移植排斥反应等病人体内血清中IL-2水平升高，表明病人T细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶联免疫吸附试验测定各种体液中活化的T细胞脱落的IL-2受体（CD25），一般来说IL-2的水平和IL-2受体水平是平行的，IL-2和IL-2受体的检测可用于对某些疾病的监测，如移杆排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治疗的病人。
对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查细胞培养上清液中细胞因子的生物活性或抗原性。现已可用核酸杂交技术，即从组织中或细胞中提取RNA，与同位素或酶标记的该种细胞因子的cDNA探针作分子杂交试验，即印迹（dot blotting）或Northern印迹，若查出有某种因子的mRNA存在，即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的能力。

⑤ 免疫分析方法有哪些

（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）。RIA技术是使用以放射性同位素（如125I、32P、3H等）作标记的抗原或抗体，用γ－射线探测仪或液体闪烁计数器测定γ－射线或β－射线的放射性强度，来测定抗体或抗原量的技术。它包括以标记抗原为特点的放射免疫分析和以标记抗体为特点的免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。

RIA在早期建立的农药免疫分析方法中占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2，4－D和2，4，5－T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫分析法。尽管该方法灵敏度非常敏锐（RIA通常为10-9g、10-12g，甚至10-15g），应用范围广，但进行RIA需使用昂贵的计数器，也存在放射线辐射和污染等问题，因此在农药残留检测领域的应用和发展受到了一定的限制，并逐步为其他免疫分析方法所取代。

（2）酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）。EIA是继RIA之后发展起来的一项免疫分析技术。其检测原理与放射免疫法类似，但所用的标记物为酶，它将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用做标记物的酶有辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GO）、脲酶（urease）等。酶标记反应的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多数采用96孔酶标板（MTP）作为固相支持物。这种板的检测容量大，样本数量多，只需有台简单的酶标仪就可得出准确的检测数据。也有学者采用磁珠作为固相材料进行EIA研究，其原理是将高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等）包裹到金属小颗粒（Fe2O3，Fe3O4）外面，再通过化学方法键合上氨基（－NH2）、羧基（－COOH）、羟基（－OH）等活性基团，再与抗体或抗原耦联，制成免疫性微珠。该方法的优点是微珠比表面积大，吸附能力强，能悬浮在液相中快速均匀的捕获样品中的待测物，通过外加磁场后能够实现微珠与样品液的快速分离，从而减少检测时间、提高检测灵敏度。

由于酶标试剂制备容易、稳定、价廉，酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，故近年来EIA技术发展很快，已开发了多种EIA方法。其中酶联免疫法（，ELISA）是目前农药残留检测中应用最广泛的酶免疫分析技术。

（3）荧光免疫分析法（fluorescenceimmunoassay，FIA）。FIA检测的基本原理是将抗原抗体的高度特异性与荧光的敏感可测性有机地结合，以荧光物质作为示踪剂标记抗体、抗原或半抗原分子，制备高质量的特异性荧光试剂。当抗原抗体结合物中的荧光物质受到紫外光或蓝光照射时，能够吸收光能进入激发态。当其从激发态回复基态时，能以电磁辐射形式放射出所吸收的光能，产生荧光。绘制农药浓度－荧光强度曲线，可以定性、定量检测样品中的农药残留量。

适用于抗体、抗原或半抗原分子标记的荧光素须符合要求：①应具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，或易转变成这类反应形式而不破坏其荧光结构；②标记后，荧光素与抗体或抗原各自的化学结构和性质均不发生改变；③荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很少；④荧光素与蛋白质结合的过程简单、快速，游离的荧光素及其降解产物容易除去；⑤结合物在一般储存条件下性能稳定，可保存使用较长时间。

（4）化学发光免疫分析法（luminescentimmunoassay，LCIA）。LCIA又可分为化学发光免疫测定（chemiluminescentimmunoassay，CLCIA）和生物发光免疫测定（bio-luminescentImmunoassay，BLCIA）。

1976年，Shroeder首先用生物素（B）－亲和素（A）系统建立了均相化学发光免疫测定技术，尔后Halman和Velan又将其引伸到非均相体系，现已渗入到生物学研究的各个领域。其原理是以发光指示抗原与抗体的结合，当发光标记物与相应的抗体或抗原结合后，底物与酶作用，或与发光剂产生氧化还原反应，或使荧光物质（例如红荧烯等）激发，释放光能。最后用光度计测定其发光强度，进行定量分析。常用发光标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）、咯粉碱（lophine）、光泽精（lucigen）、双（2、4、6－三氯苯）草酸酯、联苯三酚和6[N-（4－二氨基丁基）－N－乙基]－氨基-2，3－二氢吩嗪-1，4－二酮（ABEI）等。用上述发光标记物标记的抗体（或抗原）在一定的pH缓冲溶液中与相应的抗原（或抗体）结合时，在协同因子（例如H2O2等）的作用下发光，其发光强度与被测物的浓度成正比，故可以用于定量分析。

发光免疫测定具有特异性强、灵敏度高（检测限量达10-15mol/L）、快速（1～3h）、发光材料易得等优点。但其发光过程和强度常受到发光物质本身的化学结构、介质的pH、协同发光物质和金属离子杂质等影响。

（5）金免疫层析分析法（goldimmuno-chromatographyassay，GICA）。GICA检测原理是将配体（抗体或抗原）以线状包被固化于硝酸纤维素膜等微孔薄膜上，胶体金标记另以配体或其他物质并以干态固定在吸水材料上，通过毛细作用，使样品溶液在层析条上泳动，当泳动至胶体金标记物处时，如样品中含有待检受体，则发生第一步高度特异性的免疫反应，形成的免疫复合物继续泳动至线状包被区时，发生第二步高度特异性的免疫反应，形成的免疫复合物被截留在包被的线状区，通过标记的胶体金而显红色条带（检测带），而游离的标记物则越过检测带，与结合的标记物自动分离。通过检测带上颜色的有无或色泽深浅来实现定性或定量测定2。

2金标试纸条检测

GICA法具有快速（5～20min）、廉价、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、携带方便等优点。但相对于其他免疫分析方法，该方法检测灵敏度稍低，主要适合现场快速定性或半定量测定。目前该方法已被应用于医学和生物学等众多研究领域，尤其在发达国家已经得到了广泛的应用。

（6）免疫分析与仪器分析技术的联用技术。使用单一的IA技术进行农药残留分析获得的信息量少，而理化分析方法的选择性又比较差。Kramer等人将免疫分析法和液相色谱法（LC）联合起来使用，从而简化了分析方法，提高了检测效率。LC-IA的联用，将LC的高分离能力和IA的高灵敏性和高特异性融为一体。该分析法尤其适合多组分残留分析和微量分析。免疫分析与气相色谱/质谱（GC/MS）的联用可减少结构相似的农药或代谢产物分析中的交叉反应，以降低假阳性。

⑥ 酶联免疫法的检测方法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。 在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
⑴已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；⑵酶标记的抗原或抗体（结合物）；
⑶酶的底物；
⑷阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
⑸酶联物（结合物）及标本的稀释液；
⑹洗涤液；
⑺酶反应终止液。

⑦ 指出ELISA有哪几种常用方法各种方法在操作上有什么异同

• 也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，操作步骤如下：

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• 1） 将特异性抗体与固相载体联结。RF是一种自身抗体，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

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• 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇。

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• 2;夹心复合物"，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去，以提高试验的特异性.间接法测抗体

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• 间接法是检测抗体常用的方法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。

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• 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，测知标本中抗原的量，直接包被不易成功，可采用捕获包被法、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

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• 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体。

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• 4.竞争法测抗体

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• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质;（conjugate）：

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• 1）将特异性抗原与固相载体联结，故称为间接法。操作步骤如下，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。此法中受检标本不需稀释。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

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• 5.竞争法测抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，应注意可测范围的最高值，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质;（immunosorbent）、ayr，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.双抗原夹心法测抗体

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• 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：

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• 1.双抗体夹心法测抗原

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• 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果、adw，固相载体上只留下特异性抗体；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"：（1）固相的抗菌素原或抗体，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，在检测过程中标本须先行稀释（1。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

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• 4）加底物显色

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• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

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• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，可直接用于测定，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

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• 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

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• 3） 加酶标抗体。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，已被列为这类试剂的一项考核指标。

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• 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色、AFP。

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• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，寻找合适的标记方法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，试验中也发生假阳性反应:40~1:200）。IgG的吸附性很强，即"免疫吸附剂"，例如HBsAg，但应尽可能予以纯化。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E，从而消除RF的干扰。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。竞争法测抗体有多种模式，因此其敏感度相对高于间接法；（3）酶反应的底物、ayw4个亚型，因其不能形成两位点夹心，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

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• 2）加稀释的受检血清、HBeAg，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，以避免过高的阴性本底影响结果的判断，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

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• 2） 加受检标本、药物等ELISA测定多用此法。

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• 6.捕获包被法测抗体

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• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式。

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• 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性

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⑧ 免疫学检验常用技术有哪些

以下是几种常用的免疫学技术：
1．免疫荧光技术
免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体（或抗原）检测组织、细胞或血清 中的相应抗原（或抗体）的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此已 广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。根据荧光素标记的方式不同，可 分为直标荧光抗体和间标荧光抗体。间标荧光抗体中一抗并不直接连接荧光素， 而是先将一抗结合到蛋白，然后带有荧光素的二抗再结合至一抗。通过二抗的结 合，能将信号进行放大，因此能在一定程度上提高检测的灵敏度，但是随之带来 的高背景也降低了检测的特异性。近年来，随着荧光素和荧光检测技术的不断进 步，荧光检测的灵敏度已经接近同位素检测的水平，直接标记的荧光抗体逐渐取 代间接标记抗体。这些标记了荧光素的抗体直接结合至抗原，大大提高了检测的 特异性，使检测的结果更加准确可靠。荧光检测技术的发展，使得免疫荧光技术 在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查IgM 抗体，做为近期接触抗原的标志。利用单克隆荧光直接标记抗体鉴定淋巴细胞的 亚类。通过流式细胞仪，针对细胞表面不同抗原，可以同时使用多种不同的荧光 抗体，对同一细胞进行多标记染色。
2．放射免疫检测
放射免疫检测技术是目前灵敏度最高的检测技术，利用放射性同素标记抗 原（或抗体），与相应抗体（或抗原）结合后，通过测定抗原抗体结合物的放射 性检测结果。放射性同位素具有pg 级的灵敏度，且利用反复曝光的方法可对痕 量物质进行定量检测。但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用。

3．酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上 酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的 显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng 水平。常见用于标记的酶有辣 根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶（AP）等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器， 检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。常用的方法有间接法、夹心法以及BAS －ELISA。间接法是先将待测的蛋白抱被在孔板内，然后依次加入一抗、标记了 酶的二抗和底物显色，通过仪器（例如酶标仪）定量检测抗原。这种方法操作简 单但由于高背景而特异性较差。目前已逐渐被夹心法取代。夹心法利用二种一抗 对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。近 年来，抗原的定量检测技术也不断推陈出新。近年来，在夹心法ELISA 的基础上， 开发了多抗原检测试剂盒，能同时检测微量液相样本中多个抗原含量。这项技术 的应用大大缩短了诊断的时间，提高诊断的可靠性和及时性。
4．免疫金胶体技术
胶体金技术经过30 多年的发展到现在已日趋成熟，该方法是将二抗标记上 胶体金颗粒，利用抗原抗体间的特异性反应，最终将胶体金标记的二抗吸附于渗 滤膜上，此方法简单，快速，广泛应用于临床筛查。

⑨ 免疫检测最为灵敏的方法是

以下是几种常用的免疫学技术：1．免疫荧光技术 免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体（或抗原）检测组织、 细胞或血清 中的相应抗原（或抗体）的方法.由于荧光抗体具有安全、 灵敏的特点,因此已 广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域.根据荧光素标记的方式不同,可 分为直标荧光抗体和间标荧光抗体.间标荧光抗体中一抗并不直接连接荧光素,而是先将一抗结合到蛋白,然后带有荧光素的二抗再结合至一抗.通过二抗的结 合,能将信号进行放大,因此能在一定程度上提高检测的灵敏度,但是随之带来 的高背景也降低了检测的特异性.近年来,随着荧光素和荧光检测技术的不断进 步,荧光检测的灵敏度已经接近同位素检测的水平,直接标记的荧光抗体逐渐取 代间接标记抗体.这些标记了荧光素的抗体直接结合至抗原,大大提高了检测的 特异性,使检测的结果更加准确可靠.荧光检测技术的发展,使得免疫荧光技术 在传染病诊断上有广泛的用途,如在细菌、病毒、 螺旋体感染的疾病,检查IgM 抗体,做为近期接触抗原的标志.利用单克隆荧光直接标记抗体鉴定淋巴细胞的 亚类.通过流式细胞仪,针对细胞表面不同抗原,可以同时使用多种不同的荧光 抗体,对同一细胞进行多标记染色.2．放射免疫检测 放射免疫检测技术是目前灵敏度最高的检测技术,利用放射性同素标记抗 原（或抗体）,与相应抗体（或抗原）结合后,通过测定抗原抗体结合物的放射 性检测结果.放射性同位素具有pg 级的灵敏度,且利用反复曝光的方法可对痕 量物质进行定量检测.但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用.3．酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法.该方法是将二抗标记上 酶,抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来,根据酶作用底物后的 显色颜色变化来判断试验结果,其敏感度可达ng 水平.常见用于标记的酶有辣 根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶（AP）等.由于酶联免疫法无需特殊的仪器,检测简单,因此被广泛应用于疾病检测.常用的方法有间接法、 夹心法以及BAS －ELISA.间接法是先将待测的蛋白抱被在孔板内,然后依次加入一抗、标记了 酶的二抗和底物显色,通过仪器（例如酶标仪）定量检测抗原.这种方法操作简 单但由于高背景而特异性较差.目前已逐渐被夹心法取代.夹心法利用二种一抗 对目标抗原进行捕获和固定,在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性.近 年来,抗原的定量检测技术也不断推陈出新.近年来,在夹心法ELISA 的基础上,开发了多抗原检测试剂盒,能同时检测微量液相样本中多个抗原含量.这项技术 的应用大大缩短了诊断的时间,提高诊断的可靠性和及时性.4．免疫金胶体技术 胶体金技术经过30 多年的发展到现在已日趋成熟,该方法是将二抗标记上 胶体金颗粒,利用抗原抗体间的特异性反应,最终将胶体金标记的二抗吸附于渗 滤膜上,此方法简单,快速,广泛应用于临床筛查.