检测生物大分子的离子化方法

1. 蛋白质、核酸等生物大分子为何能用离子交换色谱分离

蛋白质、核酸等生物大分子都带有多个带电荷基团，同时伴随复杂的空间结构，因此会表现出在不同pH环境下带不同电荷的表观现象。以蛋白质为例，蛋白质有多个氨基酸组合而成，而氨基酸本身带有氨基和羧基，二者在不同的pH环境下可带正、负电荷，这就导致了氨基酸在不同pH环境下带不同的电荷。人们根据生物大分子在不同的环境下带电荷不同设计了离子交换来分离该大分子。当然这只是分离的一种手段，一般来说分离生物大分子会利用多种分子特性如疏水性等设计一系列分离方案，来得到纯度较高的生物大分子。

2. LC-MS法 是什么

高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。质谱可以和气相联用如GC/MS,也可以和高效液相色谱联用如HPLC/MS。由于色谱和质谱灵敏度相当，再加上分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪速度快，分离好，应用广。色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。
在1970年后，质谱-质谱法（mass separetion-mass spectra Characterization）迅猛发展起来。这种方法让母离子进一步裂解，从而获得裂解过程和分子结构的信息，通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等。
我们知道，质谱的分析建立在物质离子化的基础上，按照荷质比分离离子，通过测量离子谱峰的强度实现分析目的。通过色谱纯化后的样品气化离子化形成的离子在电场和磁场的综合作用下，按照质量数和电荷数的比值大小依次排列成谱被记录下来。常见的质谱图的纵坐标是离子信号强度，横坐标就是离子核质比。在液相色谱质谱中通常所用的离子源有ESI和APCI，我们常用的是ESI。ESI 是比APCI软电离程度较小的电离方式，应用范围较APCI 的大，只有少部分有机分子ESI 做不出，可以用APCI 辅助解决问题。 一般用ESI 和 APCI 搭配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。
ESI 和APCI通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子，源参数调整简单，容易使用，仪器灵敏度高。对APCI源来说，不足就是给出的结构信息有限，样品易发生热裂解，低质量时基线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰，可以直接测定混合物，并可以测定热不稳定的极性化合物。其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA 等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）得到化合物的部分结构。
当然有机质谱也有自身局限性。有机分子多数有异构体，而质谱在立体化学方面区分能力差；色谱的重复性稍微差一些，需要严格控制操作条件，不能像NMR，IR等可以直接动手操作，需要专人负责；质谱有离子源的记忆效应，操作起来也很复杂；尽管如此，色谱-质谱联用在天然产物的分析〔1〕，药物代谢结合物（如苯丙酮尿症PKU）的测定〔2〕，药物合成的监测（如Ractopamine）〔3〕具有重要的应用。美国耶鲁大学教授J.Fenn等1984年首次发表ESI－MS的研究成果，并于1988年成功地进行了蛋白质的分析。
先天性疾病中有很大一部分是先天性遗传代谢疾病，就目前医学发展已经了解的有一百多种。这些疾病虽不致死，但是对患儿的智力和体格可能造成痴呆、残缺和畸形，是家庭、社会、国家的沉重负担。目前有30多种代谢失常遗传性疾病如各种氨基酸代谢失常血症包括同构胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症、短链和长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(SCAD和LCAD)、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其它各种有机酸代谢失常疾病等都可用LC/MS/MS进行临床检测〔4〕。
我们知道，保证药品质量的一个重要方面是杂质检查及限度控制，使用LC/MS/MS可以很方便的对药品进行监控。Nicolas建立了不同批次抗癌药物DuP941的LC/MS/MS谱图达到质量控制目的；Rourick建立了鉴定药品杂质的方法，利用LC/MS/MS功能鉴定头孢羟氨苄降解产物的结构。对分析化学家来说是一个挑战的体内药物分析利用LC/MS/MS也显示很大的优越性。有报道Takeshi对血液和尿液中11个添加的吩噻嗪类药物进行分析，采用SPME和LC分离经MS/MS检测。Wong开展了微透析-LC/MS/MS生物活体分析，将微透析探针插入动物的颈动脉，实时了解松果体素在体内的生化过程和代谢情况。LC/MS/MS还可以鉴别体液中很多药物，这在很多文献中都有报道〔5,6〕。
LC/MS/MS也用于生物技术中分子量的测定〔7〕。对分子量10000以上的蛋白质用离子喷雾技术进行精确的质量测定是常规的分析。有研究用离子喷雾测定甲硫酸氨基-人体生长激素(MET-HGH)的分子量为22,256.32±0.44Dr，与实际计算分子量22,256.2Dr相差很小。同聚丙烯酰胺凝胶电泳、蔗糖密度离心法等经典的蛋白质分子量测定技术相比，分析时间短，样品消耗少，测定快捷准确。还有研究者利用LC/MS/MS开展DNA-药物结合态的分析，蛋白质与金属离子配位研究〔8〕。
司法鉴定中LC/MS/MS也是毒品检测的一个有力工具〔9〕。Soenoff建立了新生婴儿血液中苯甲酰爱康宁的确证方法，这就可以对可疑吸毒者出生的婴儿进行鉴定。Clauwean用LC/MS/MS和LC/荧光检测了头发中可卡因及其代谢物，得到的结果是一致的，并且在很低的浓度时仍可以进行MS/MS全扫描。Wang对可卡因和它的15个代谢物的裂解机理在改变CID源和标准品的条件下进行了深刻探讨，取得很大的成就。
LC/MS/MS在食品检测中的地位更是不可低估。例如蜂蜜中氯霉素的LC/MS/MS 分析，鱼肉中孔雀石绿的LC/MS/MS 分析，LC/MS/MS同时分析多种抗生素，动物组织中19种β肾上腺素兴奋剂的检测，苏丹红的LC-MS/MS方法的测定，水果和蔬菜中100种农药及其代谢物的同时检测，干炸食品中丙烯酰胺的测定。硝基呋喃是国际动物源性食品贸易的必检项目,硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因,用于治疗和预防由埃希氏菌和沙门氏菌引起的哺乳动物消化道疾病。研究发现,呋喃西林、呋喃唑酮及其代谢物具有致癌作用〔10〕。
1995年欧盟禁止在食用动物中使用硝基呋喃类药物, 2002年我国颁布了禁止使用该类兽药的禁令〔11〕。虽然硝基呋喃类药物代谢快而且对光敏感,母体化合物在动物体及产品中很快就降至检出限以下,但其代谢物以蛋白结合物的形式在体内可残留较长时间〔12，13〕。
目前,各国均将硝基呋喃代谢物作为指示硝基呋喃类药物残留的标示物。彭涛用高效液相色谱/串联质谱(LC/MS/MS)法同时测定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代谢物。各界对此都进行了积极的研究〔14,15〕。
随着科技发展，分析领域对仪器的要求的不断提高，制药行业对0.1%含量的杂质要求定性和定量，在增加检测的选择性和灵敏度基础上得到更多化合物的信息和增加可分析化合物种类，对我们分析人员也是一种挑战。HPLC/MS/MS结合了LC的强大的分离分析能力和MS灵敏的鉴定及结构解析能力，提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，作为当今最重要的分离和鉴定方法之一，在分析化学领域中发挥着更加重要的作用

3. MALDI和ESI哪个是更合适的离子化方法

和ESI
相比，相应的MALDI
对有较大分子量、更强疏水性和更低
等电点
的肽的检测能力更强。对MS
检测器的最优选择基于何种应用。
离子化:
个人觉得MALDI
更高，因为相对来说单位的样品可以得到的能量更为集中，且激光的能量更为可控，所以我个人的理解是其离子化的效率更高些。ESI
在氮吹过程中应该存在大部分样品损失的情况。
传输效率:
我觉得这个仍然是
MALDI
更为有优势。大家知道，MS
的性能与其真空度是正相关的，MALDI
对真空度不存在直接的对应
使用环境
，即可以实现很好的真空度。而
ESI
则不行。MALDI
类型的质谱仪高灵敏度的实现我想有以上事实很大一部分的功劳。
两种离子源应该都是在其最优状态下进行工作，而且样品也是各自更为适用的类型。这样的讨论才具有可行性。
MALDI
在离子化效率问题上是弱于ESI
的，在离子传输效率上是强于ESI
的
ESI:
大分子且不易挥发。要加附加
电解质
使中性大分子带电而被分离。主要看
分子离子峰
(正离子分离:+
Na+,
K+等;负离子分离:+
Cl-等)
MALDI:
一般有机分子到大分子都可以。分子先被离子化，成碎片进入质谱分析仪。能看到
碎片离子
峰。能得到较多的
化学信息
。

4. 用于微生物检测鉴定的质谱技术主要有哪些

用于微生物检测鉴定的质谱技术主要有哪些
质谱随着科学技术的进步，20世纪80年代以来，有4种软电离技术产生，分别为等离子体解吸（PD-MS）、快原子轰击（FAB ）、电喷雾（ESI ）和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）。
等离子体解吸的原理是：采用放射性同位素的核裂变碎片作为初级粒子轰击样品使其电离，样品以适当溶剂溶解后涂布于0.5-1µm 厚的铝或镍箔上，核裂变碎片从背面穿过金属箔，把大量能量传递给样品分子，使其解吸电离。在制备样品时，采用硝化纤维素作为底物使得PD-MS 可用以分析分子量高达14 000 的多肽和蛋白质样品。
快原子轰击的原理是，一束高能粒子，如氩、氙原子，射向存在于液态基质中的样品分子而得到样品离子，这样可以得到提供分子量信息的准分子离子峰和提供化合物结构信息的碎片峰。快原子轰击操作方便、灵敏度高、能在较长时间里获得稳定离子流。当用于绝大多数生物体中寡糖及其衍生物的分析时，可测分子量达6000。而且在该质量范围内，其灵敏度远高于在15000 范围
内新一代全加速仪器的灵敏度。此外，Camim 等采用FAB-MS 分析从Hafnia alvei中得到的四个寡糖组分，检测到了NMR 不能观测到的寡糖、并揭示了寡糖结构的非均一性。
电喷雾电离的原理是：喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供净电荷；在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；荷电微滴中溶剂的蒸发；微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。为了降低微滴的表面能，加热至200～250℃，可使喷雾效率提高。FAB-MS 可以显示碎片离子，但只能产生单电荷离子，因此不适用于分析分子量超过分析器质量范围的分子。ESI 可以产生多电荷离子，每一个都有准确的小m/z 值。此外还可以产生多电荷母离子的子离子，这样就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息。而且，ESI-MS 可以补充或增强由FAB 获得的信息，即使是小分子也是如此。
质谱仪
基质辅助激光解吸离子化质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS) 是20世纪80 年代末问世并迅速发展起来的质谱分析技术。这种离子化方式产生的离子常用飞行时间(time of flight，TOF)检测器检测，因此MALDI常与TOF一起称为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。MALDI-TOF-MS技术，使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革，从此迈入生物质谱技术发展新时代。该技术的特点是采用被称为“软电离”方式，一般产生稳定分子离子，因而是测定生物大分子分子量的有效方法，广泛地运用于生物化学，尤其对蛋白质、核酸的分析研究已经取得了突破性进展。MALDI-MS 在糖研究中的应用，也显示出一定的潜力和应用前景。另外在高分子化学、有机化学、金属有机化学、药学等领域也显示出独特的潜力和应用前景，已经成为广大科技工作者研究于分析大分子分子质量、纯度、结构的理想工具。其广泛应用于生物化学领域，

5. 实验室测定蛋白质分子量的方法有哪些

测定蛋白质分子量的常用方法：

粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳、渗透压法、质谱法包括电喷雾离子化质谱技术和基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法（多角度激光散射）、沉降法（超速离心法）。

1、粘度法

一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为：

8、电喷雾离子化质谱技术

电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS 测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量，由于ESI-MS可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。

优缺点：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。

9、基质辅助激光解吸电离质谱技术

基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。基体的作用在于保护待测物不会因过强的激光能量导致化合物被破坏。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。

优缺点：（1）同ESI-MS 一样对样品的消耗很少；（2）随着质量分析器的不断改进、新的基质的不断发现和应用以及延迟萃取技术的使用，使得MALDI-MS 的最高分辨率不断提高，甚至超过ESI-MS；（3）MALDI-MS 单电荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；（4）MALDI-TOF 质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广的。

6. 什么是基质辅助激光解吸附离子化质谱法

MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption)
基质辅助激光解吸离子化，是一种用于大分子离子化方法，利用对使用的激光波长范围具有吸收并能提供质子的基质（一般常用小分子液体或结晶化合物），将样品与其混合溶解并形成混合体，在真空下用激光照射该混合体，基体吸收激光能量，并传递给样品，从而使样品解吸离子化。MALDI的特点是准分子离子峰很强。通常将MALDI用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合分析蛋白质,多肽等大分子。
它是一种脉冲式电离源

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7. 质谱法中EIS离子化和EI电离有什么不同

电喷雾电离(electrospray ionization,ESI )电离源.质谱仪中较为常用的一种离子化方式.电喷雾离子源属于一种软电离源,能使大质量的有机分子生成带多电荷的离子,通常认为电喷雾可以用两种机制来解释.（1）小分子带电残基机制：在喷针针头与施加电压的电极之间形成强电场,该电场使液体电,带电的溶液在电场的作用下向带相反电荷的电极运动,并形成带电的液滴,由于小雾滴的分散,比表面增大,在电场中迅速蒸发,结果使带电雾滴表面单位面积的场强极高,从而产生液滴的“爆裂”重复此过程,最终产生分子离子.(2)大分子离子蒸发机制：首先也是电场使溶液带电,结果形成带电雾滴&带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶,溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上,结果形成离子化的分子.一般来讲,电喷雾方法适合使溶液中的分子带电而离子化.离子蒸发机制是主要的电喷雾过程,但对质量大的分子化合物,带电残基的机制也会起相当重要的作用.电喷雾也可测定中性分子,它是利用溶液中带电的阳离子或阴离子吸附在中性分子的极性基团上而产生分子离子.EI:电子电离源(Electron Ionization EI) 电子电离源又称EI源,是应用最为广泛的离子源,它主要用于挥发性样品的电离.图9.1是电子电离源的原理图,由GC或直接进样杆进入的样品,以气体形式进入离子源,由灯丝F发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离.一般情况下,灯丝F与接收极T之间的电压为70伏,所有的标准质谱图都是在70ev下做出的.在70ev电子碰撞作用下,有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子,也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子.由分子离子可以确定化合物分子量,由碎片离子可以得到化合物的结构.对于一些不稳定的化合物,在70ev的电子轰击下很难得到分子离子.为了得到分子量,可以采用1020ev的电子能量,不过此时仪器灵敏度将大大降低,需要加大样品的进样量.而且,得到的质谱图不再是标准质谱图.离子源中进行的电离过程是很复杂的过程,有专门的理论对这些过程进行解释和描述.在电子轰击下,样品分子可能有四种不同途径形成离子：样品分子被打掉一个电子形成分子离子.分子离子进一步发生化学键断裂形成碎片离子.分子离子发生结构重排形成重排离子.通过分子离子反应生成加合离子.此外,还有同位素离子.这样,一个样品分子可以产生很多带有结构信息的离子,对这些离子进行质量分析和检测,可以得到具有样品信息的质谱图.电子电离源主要适用于易挥发有机样品的电离,GC-MS联用仪中都有这种离子源.其优点是工作稳定可靠,结构信息丰富,有标准质谱图可以检索.缺点是只适用于易汽化的有机物样品分析,并且,对有些化合物得不到分子离子

8. 检测生物大分子在细胞组织中分布的常用方法有哪些

1.PAS反应显示糖原
2.福尔根反应后的DNA吸收546nm可见光特性，采用显微分光光度检测细胞中的含量
3.米伦反应检测蛋白质
4.苏丹Ⅲ，四氧化锇脂类显色

9. 质谱的技术

质谱随着科学技术的进步，20世纪80年代以来，有4种软电离技术产生，分别为等离子体解吸（PD-MS）、快原子轰击（FAB ）、电喷雾（ESI ）和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）。
等离子体解吸的原理是：采用放射性同位素的核裂变碎片作为初级粒子轰击样品使其电离，样品以适当溶剂溶解后涂布于0.5-1µm 厚的铝或镍箔上，核裂变碎片从背面穿过金属箔，把大量能量传递给样品分子，使其解吸电离。在制备样品时，采用硝化纤维素作为底物使得PD-MS 可用以分析分子量高达14 000 的多肽和蛋白质样品。
快原子轰击的原理是，一束高能粒子，如氩、氙原子，射向存在于液态基质中的样品分子而得到样品离子，这样可以得到提供分子量信息的准分子离子峰和提供化合物结构信息的碎片峰。快原子轰击操作方便、灵敏度高、能在较长时间里获得稳定离子流。当用于绝大多数生物体中寡糖及其衍生物的分析时，可测分子量达6000。而且在该质量范围内，其灵敏度远高于在15000 范围
内新一代全加速仪器的灵敏度。此外，Camim 等采用FAB-MS 分析从Hafnia alvei中得到的四个寡糖组分，检测到了NMR 不能观测到的寡糖、并揭示了寡糖结构的非均一性。
电喷雾电离的原理是：喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供净电荷；在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；荷电微滴中溶剂的蒸发；微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。为了降低微滴的表面能，加热至200～250℃，可使喷雾效率提高。FAB-MS 可以显示碎片离子，但只能产生单电荷离子，因此不适用于分析分子量超过分析器质量范围的分子。ESI 可以产生多电荷离子，每一个都有准确的小m/z 值。此外还可以产生多电荷母离子的子离子，这样就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息。而且，ESI-MS 可以补充或增强由FAB 获得的信息，即使是小分子也是如此。
质谱仪
基质辅助激光解吸离子化质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS) 是20世纪80 年代末问世并迅速发展起来的质谱分析技术。这种离子化方式产生的离子常用飞行时间(time of flight，TOF)检测器检测，因此MALDI常与TOF一起称为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。MALDI-TOF-MS技术，使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革，从此迈入生物质谱技术发展新时代。该技术的特点是采用被称为“软电离”方式，一般产生稳定分子离子，因而是测定生物大分子分子量的有效方法，广泛地运用于生物化学，尤其对蛋白质、核酸的分析研究已经取得了突破性进展。MALDI-MS 在糖研究中的应用，也显示出一定的潜力和应用前景。另外在高分子化学、有机化学、金属有机化学、药学等领域也显示出独特的潜力和应用前景，已经成为广大科技工作者研究于分析大分子分子质量、纯度、结构的理想工具。其广泛应用于生物化学领域，

10. 如何用液相色谱法分离生物大分子

疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法.蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团,我们把这些疏水性基团称为疏水补丁,疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合.不同的分子由于疏水性不同,它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同,疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的.反向液相色谱RPC一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间.它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分离效果改善.疏水作用层析：溶液配置简单,性状温和,能保持蛋白活性,但操作复杂,分离效率低反向液相色谱：洗脱液要求高,蛋白变性,操作简单,分离效率高