Ⅰ 测啤酒酒精度时样品的制备有哪些方法
啤酒微生物检验技术
1.1无菌室
1.1.1无菌室标准
无菌度：10000级；温度：20℃－25℃；湿度：＜60%；压力：0.5Pa，正压，＜1.5Pa。
1.1.2无菌室管理
（1）微生物操作人员必须具有严格的无菌意识；
（2）操作人员要换上无菌室专用的工作服、鞋、帽、口罩，经风淋门进入；
（3）无菌室内始终保持正压，防止外界空气进入；
（4）外人不得进入无菌室，不用的物品应及时拿出；
（5）定期开紫外灯杀菌，休假日，紫外灯不关；
（6）每周做一次空间卫生检查；
（7）每天工作之前和结束后，清扫无菌室。
1.1.3培养基
1.1.3.1培养基类型
（1）麦汁琼脂培养基：检出酵母；
（2）营养琼脂培养基：检出一般细菌；
（3）NBB（NBB－A、NBB－B、NBB－C）培养基：检查啤酒有害菌。
1.1.3.2培养方法
（1）一般细菌使用营养琼脂培养基，培养温度37℃，有氧培养24小时；
（2）酵母使用麦汁琼脂培养基，培养温度25℃－28℃，有氧培养48小时；
（3）厌氧菌使用NBB培养基，培养温度25℃－28℃，厌氧平板培养5天－7天，或液体培养1星期－2星期。
1.1.3.3结果鉴定
（1）镜检：液体培养基中观察混浊沉淀的产生，固体培养基上观察菌落的形成；
（2）产酸情况的观察：若细菌产酸，则培养基的pH值在培养后会发生变化；
（3）闻气味：有些有害菌的代谢产物具有特殊气味，可根据培养后的气味帮助鉴定；
（4）革兰氏染色：用KOH实验法判定菌落的革兰氏阳性和阴性；
（5）过氧化氢酶实验：将纯菌落涂到干燥的载玻片上，滴一滴3%过氧化氢液，好氧菌和兼性好氧菌含有过氧化氢酶，能分解过氧化氢：
过氧化氢酶
2H2O2————→2H2O＋O2
逸出的氧气形成气泡，显示对过氧化氢酶实验阳性；厌氧菌和兼性厌氧菌不能起反应，为过氧化氢酶实验阴性。
1.1.4对大肠杆菌的检测：大肠杆菌对啤酒厂来说是最严重的污染元素，因此，日常检测非常重要。下面，就是我公司的检测步骤：
1.1.4.1设备和材料
温箱：36±1℃；水浴：44±0.5℃；天平；显微镜；均质器或乳体；温度计；平皿；试管；吸管；载玻片。
1.1.4.2培养基及乳体
乳糖胆盐发酵管；伊红美蓝发酵管；乳糖发酵管；蛋白胨水；革兰氏染色液；靛基质试剂。
1.1.4.3大肠菌群检验程序（表1）
1.1.4.4操作步骤
（1）检样稀释
①以无菌操作将检样25mL（或25g）放于含有225mL灭菌生理盐水，或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），或灭菌乳钵内，经充分震荡或研磨，做成1∶10的均匀稀释液。②用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。
③另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
④根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。
（2）乳糖发酵实验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及以下者，用单料乳糖发酵管。每一稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如果所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
（3）分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18h—24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。
（4）证实实验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个—2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。
（5）报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数。
1.2加强微生物检测操作人员的培训
（1）强化微生物检测人员的无菌意识；
（2）提高微生物检测人员的操作技能；
（3）微生物检测人员一定要注意个人卫生；
（4）个人物品不准随便放于无菌室内；
（5）上班后，立即更换工作服，不穿工作服不准进入无菌室；
（6）取样要准确，确保取样过程的无菌操作；
（7）加强无菌操作，杜绝因操作有误引起的菌检不合格；
（8）严格执行无菌室的杀菌程序，定期开紫外灯杀菌；
（9）加强学习，充分利用当前先进的检测技术，争取在最短检测时间内通知车间。
1.3加强对取样瓶和培养皿的卫生管理
（1）定期对取样瓶和培养皿蒸汽杀菌，要求温度在120℃，时间≥30分钟；
（2）用完后，取样瓶和培养皿须及时刷洗，以备杀菌再用；
（3）超过20天的取样瓶和培养皿，不能再取样使用，必须重新杀菌后再用；
（4）杀菌后的取样瓶和培养皿保存好，杜绝二次污染。
1.4取样
保证无菌操作。
1.4.1取样阀应具备条件
（1）无杀菌死角，保证无菌状态；
（2）压缩空气的取样阀应设置在过滤器后直接通往使用区的管路上，每一分管可以反映各自的无菌
状态；
（3）管路尽可能缩短；
（4）高度应距地面1.2m－1.5m，有利于取样的无菌操作。
1.4.2取样方法
先用酒精喷灯灼烧取样口，放掉一部分样液（防止因取样口温度较高，取出的样品细菌数比实际少），再用酒精喷灯封口，在无菌状态下快速用无菌瓶取样。
1.5啤酒病害微生物
1.5.1啤酒有害菌对产品的不良影响
（1）产生异味；
（2）引起混浊和沉淀；
（3）黏度提高；
（4）压力升高。
1.5.2野生酵母（表2）
指不为啤酒正常生产所用，在啤酒酿造过程中，易引起不正常发酵或产生病害的异种酵母。
1.5.3细菌（表3）
分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
2微生物污染途径（表4）
3啤酒生产过程中的检测点（表5）
4制麦的卫生管理
4.1微生物对大麦的影响
在田间侵染大麦的微生物被称为“田间真菌”。麦穗刚从叶梢中露出就受到各种微生物的侵染，潮湿阴雨的天气会增加大麦受污染的程度，生长后期倒伏也会使微生物大量生长，因此，无论是购买进口大麦还是国产大麦，都要把大麦的生长天气考虑进去。
4.2微生物对仓储大麦的影响
污染储藏大麦的菌群主要是曲霉菌和青霉菌，其主要来源：一是田间感染；二是收获和储存过程中感染。因此，大麦的储存条件，基本上就决定了这些微生物能否在大麦上进一步生长。其中，含水量和温度很重要，含水量在13%以下，安全温度为15℃，通常以7℃－9℃为好。4.3微生物对制麦过程的影响
大麦在制麦时的浸麦度达到43%－48%，发芽温度12℃－18℃，该条件有利于微生物的繁殖。
4.4制麦微生物对啤酒质量的影响
大麦和麦芽微生物的影响是贯穿啤酒生产始终的。制麦时微生物过多，会抑制大麦的发芽，使麦芽溶解不良、增加色度、产生不良异味。同时在啤酒生产中，降低了啤酒的气体稳定性，可引起啤酒的喷涌。关于啤酒喷涌的原因，目前发现主要是由于大麦和麦芽受到微生物的污染而引起的，如交链孢霉、黄曲霉等。此外，污染微生物还能影响胶体的稳定性。
转自：a href="food.ocn/200884/Info200884471.html" target="_blank"food.ocn/200884/Info200884471.html/a
Ⅱ 微生物生长的常用检测方法
一、生长量测定法
1.1体积测量法：又称测菌丝浓度法。
通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
1.2称干重法：
可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
1.3比浊法：
微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。
1.4菌丝长度测量法：
对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适
的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长
二、微生物计数法
2.1血球计数板法:
血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2.2染色计数法：
为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。
2.3比例计数法：
将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的'细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。
2.4液体稀释法：
对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（mostprobablynumber）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。
2.5平板菌落计数法：
这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。
2.6试剂纸法：
在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色）待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。
2.7膜过滤法：
用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。
2.8生理指标法：
微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。
2.9测定含氮量：
大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。
2.10测定含碳量：
将少量（干重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加热30分钟后冷却。加水稀释至5毫升，在580nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。
2.11还原糖测定法：
还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。
2.12氨基氮的测定：
方法是，离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02N的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。
2.13其他生理物质的测定：
P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸，产气，产CO2（用标记葡萄糖做基质），耗氧，黏度，产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如我所在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。
拓展：微生物的现代定义
肉眼难以看清，需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称。微生物包括细菌、病毒、真菌和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞结构分类分为原核微生物和真核微生物。
微生物的主要特征
体小面大
一个体积恒定的物体，被切割的越小，其相对表面积越大。微生物体积很小，如一个典型的球菌，其体积约1mm，可是其表面积却很大。这个特征也是赋予微生物其他如代谢快等特性的基础。
吸多转快
微生物通常具有极其高效的生物化学转化能力。据研究，乳糖菌在1个小时之内能够分解其自身重量1000-10000倍的乳糖，产朊假丝酵母菌的蛋白合成能力是大豆蛋白合成能力的100倍。
生长繁殖快
相比于大型动物，微生物具有极高的生长繁殖速度。大肠杆菌能够在12.5-20分钟内繁殖1次。不妨计算一下，1个大肠杆菌假设20分钟分裂1次，1小时3次，1昼夜24小时分裂24×3=72次，大概可产生4722366500万亿个（2的72次方），这是非常巨大的数字。但事实上，由于各种条件的限制，如营养缺失、竞争加剧、生存环境恶化等原因，微生物无法完全达到这种指数级增长。 已知大多数微生物生长的最佳pH范围为7.0 (6.6~7.5)附近，部分则低于4.0。
微生物的这一特性使其在工业上有广泛的应用，如发酵、单细胞蛋白等。微生物是人类不可或缺的好朋友。
适应强 易变异
分布广 种类多
微生物对我们生活的影响
微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。
微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。
微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，我们发现的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。
微生物间的相互作用机制也相当奥妙。例如健康人肠道中即有大量细菌存在，称为正常菌群，其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收，菌群在这些过程中发挥的作用，以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调，就会引起腹泻。
随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以及从事的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。
工业微生物涉及食品、制药、冶金、采矿、石油、皮革、轻化工等多种行业。通过微生物发酵途径生产抗生素、丁醇、维生素C以及一些风味食品的制备等；某些特殊微生物酶参与皮革脱毛、冶金、采油采矿等生产过程，甚至直接作为洗衣粉等的添加剂；另外还有一些微生物的代谢产物可以作为天然的微生物杀虫剂广泛应用于农业生产。通过对枯草芽孢杆菌的基因组研究，发现了一系列与抗生素及重要工业用酶的产生相关的基因。乳酸杆菌作为一种重要的微生态调节剂参与食品发酵过程，对其进行的基因组学研究将有利于找到关键的功能基因，然后对菌株加以改造，使其更适于工业化的生产过程。国内维生素C两步发酵法生产过程中的关键菌株氧化葡萄糖酸杆菌的基因组研究，将在基因组测序完成的前提下找到与维生素C生产相关的重要代谢功能基因，经基因工程改造，实现新的工程菌株的构建，简化生产步骤，降低生产成本，继而实现经济效益的大幅度提升。对工业微生物开展的基因组研究，不断发现新的特殊酶基因及重要代谢过程和代谢产物生成相关的功能基因，并将其应用于生产以及传统工业、工艺的改造，同时推动现代生物技术的迅速发展。
经济作物柑橘的致病菌是国际上第一个发表了全序列的植物致病微生物。还有一些在分类学、生理学和经济价值上非常重要的农业微生物，例如：胡萝卜欧文氏菌、植物致病性假单胞菌以及中国正在开展的黄单胞菌的研究等正在进行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也刚刚测定完成。借鉴已经较为成熟的从人类病原微生物的基因组学信息筛选治疗性药物的方案，可以尝试性地应用到植物病原体上。特别像柑橘的致病菌这种需要昆虫媒介才能完成生活周期的种类，除了杀虫剂能阻断其生活周期以外，只能通过遗传学研究找到毒力相关因子，寻找抗性靶位以发展更有效的控制对策。固氮菌全部遗传信息的解析对于开发利用其固氮关键基因提高农作物的产量和质量也具有重要的意义。[10]
在极端环境下能够生长的微生物称为极端微生物，又称嗜极菌。嗜极菌对极端环境具有很强的适应性，极端微生物基因组的研究有助于从分子水平研究极限条件下微生物的适应性，加深对生命本质的认识。