常见载体及连接方法

‘壹’ 能将目的基因与载体的链接方法说的详细一点吗谢谢！

载体一般用质粒，质粒是环状的DNA分子。用限制酶将目的基因切下来后，用同样的限制酶去切质粒，这样质粒就变成了一个带缺口的环状DNA，又因为质粒和目的基因是用同种限制酶切下来的，所以它们的黏性末端的碱基是相同的，在DNA连接酶的作用下，碱基互补配对，DNA连接酶连接的是脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，这样，目的基因就与载体连接在一起了。

‘贰’ 常用的目的基因与载体的连接方法有哪些

目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：
第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；（人教版高中生物选修3中提到的E·coliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。）
第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；
第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。
粘性末端DNA片段的连接
DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。
平末端DNA片段的连接
常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。

‘叁’ 分子克隆中常用的连接方法

方法：DNA片段的制备、载体的选择、片段与载体连接。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。

基因克隆是一个比较直观而简单的操作程序。它之所以具有非常重要的生物学意义，是因为这一技术可以为我们提供一个纯粹的基因标本。

通常，一个基因总是和细胞里其他基因同在。基因克隆技术诞生之前，我们根本无法纯化单个基因，这意味着我们只能对基因群、而不是特定基因的结构与功能进行研究和开发利用。

重要意义与应用

分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。

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‘陆’ 【求助/交流】目的基因与表达载体连接时有哪些要点

2.片段和载体酶且要完全，确定大小没问题 不过有些载体本身就很很难连接！ 建议在连接时，先加入载体和目的基因，85度热浴15min,除去残留的酶和未纯化干净的杂蛋白。然后再加入酶和BUFFER。 适当延长连接时间24小时以内都没问题的！ 如果还是不行，就试试对载体去磷酸化，每一步处理都要在结束后热变性，失活残留的酶，适当加大目的基因的量（10以内），连接温度也可以在4-16度内用PCR做个梯度！不过如果有平末端的，就不用做这个梯度了。dfdxhghg(站内联系TA)我们只做医学论文，所以更专业！我们全部的工作人员均来自医学院校和附属医院，全部拥有硕士以上学历，有丰富的论文写作经验。做医学论文，我们有比其他公司无法比拟的优势！很多论文公司的人员根本不懂医学，医学论文等专业知识上面很难沟通和探讨。

‘柒’ 分子克隆中常用的连接方法及原理

方法：DNA片段的制备、载体的选择、片段与载体连接。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。

原理：外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。

但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

载体DNA的选择

质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

以上内容参考：网络-分子克隆