瘦肉精快速检测的方法

1. 瘦肉精检测问题

目前，检测瘦肉精的方法主要有四种，即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GC－MS）、毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）。而我国结合自己的实际情况，2001年农业部首先组织制定了饲料中盐酸克伦特罗的测定标淮。该标准选择确定了两种：即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GC－MS）。其中将HPLC法作为检测瘦肉精的半确证性方法，其最低检测限为 0．05μg/kg，优点是检测精确度高，而且假阳性率低；缺点是检测过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。而GC一MS法优点是能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析。GC－MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低，已将GC－MS法定为检测瘦肉精的确证性方法。GC－MS法的缺点同HPLC相似。 (1)试剂和材料 以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB／T6682规定的二级水。 ①盐酸克伦特罗对照品：含盐酸克伦特罗不得少于98．5％ ②盐酸 ③无水甲醇 ④氢氧化钠 ⑤磷酸二氢钾 ⑥磷酸 ⑦盐酸溶液 取盐酸4．2ml，加水至1000ml，即得。 ⑧o．5mol／L磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾68g，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．O，用水稀释至1000ml，即得。 ⑨0．05mol几磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾6．88，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．0，用水稀释至1000mi，即得。 a．氢氧化钠溶液 取氢氧化钠48，加水使溶解成100mi，即得。 b．盐酸克伦特罗对照品储备液(1mg／mi) 准确称取28．3mg盐酸克伦特罗对照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。 ⑩盐酸克伦特罗对照品工作液(10ttg／mi) 取lmg／mi储备液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。 ⑾盐酸克伦特罗对照溶液(100ng／m1) 取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。 ⑿盐酸克伦特罗检测试剂盒(2～8~C冰箱中保存) ⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％ (2)仪器和设备 ①酶联免疫反应读数仪 ②分析天平 精度0．00001g ③天平 精度0．01g ④冷冻离心机 ⑤50mi具塞离心管 ⑥匀浆机 ⑦微型振荡器 ⑧回旋振荡器 ⑨微量移液器 单道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL， ⑩干热浓缩器 ①空气压缩机 (3)测定步骤 ①试料的制备(尿) 取供试尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为供试试料，直接供酶联免疫测定法测定。 取空白尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为空白试料，直接供酶联免疫测定法测定。 取空白尿2ml，于3000r／min离心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克伦特罗对照溶液20／H。作为2ug/l空白添加试料，直接供酶联免疫测定法测定。 ②试料的制备(肝) 取约l00g新鲜或冷冻后融化的空白或供试猪肝,用匀浆机以10000r／rain匀浆1-2min，使均匀呈糊状，一20~C以下冰箱中贮存备用。 取均浆后的供试肝样，作为供试试料。 取均浆后的空白肝样，作为空白试料。 取均浆后的空白肝样(1土0．05)e添加l00ng／m1的克伦特罗对照溶液20tzL作为2ng／g空白添加试料。 a：提取(肝) 取(1士o．05)z试料，置50ml离心管中；加盐酸溶液5.0mi，旋涡混匀，中速振荡1．5h；在10-15~C下以4000r／mill以上速度离心15min；上清液移人另一50ml离心管中，加入氢氧化钠溶液300gL，混匀，振荡15min；加0.5mol／l磷酸二氢钾溶液4。0ml，混匀，2-8~C放置过夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度离心15min，上清液备用。 b．净化(肝) C，，固相萃取柱依次用无水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2mi预洗，不使柱床干涸；将备用上清液全部过柱；用0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2ml淋洗，挤干，弃去所有淋洗液；用无水甲醇2mi洗脱，流速控制在0.5ml／mm以下，挤干，收集洗脱液；于50～60~C下用氮气或空气缓缓吹干洗脱液；残余物用水1.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度离心15rain，清液作为试样溶液供酶联免疫测定法测定。 ③测定 a．室温应控制在19～30~C。 b．取在19-30~C放置1-2h的试剂盒，按每个标准溶液和试样溶液至少两孔计算所需酶联板条的数量，插入框架。每个微孔加入用缓冲溶液100倍稀释的抗体100~tL，封口膜封板，室温孵育30min。 c倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。用多道移液器加水250pL到酶联板的微?L内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板3次。 d．分别吸取标准溶液、空白试料、空白添加试料和供试试料各20uL，分别放入不同微孔底中央，并在每孔内加入用缓冲溶液100倍稀释的酶结合物100~I。，在微型振荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30min。 e．倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，重复洗板3次。 f．用多道移液器加入用底物缓冲溶液10倍稀释的底物100uL，室温避光孵育15min。 g．用多道移液器每孔加终止液100uL。 h．在1h内将酶联板放于酶标仪内，于450nm波长处测定吸光度值。 (4)计算 用数据分析软件对结果进行分析，绘出标准曲线，并得出试料中克伦特罗的含量。 (5)灵敏度和回收率 本方法的平均检测下限为0.1mg／Kg。 本方法在1ug／kg添加浓度水平上猪尿回收率范围为60％一120％，猪肝回收率范围为40％～120％。参考资料/ http://www.zgny17.com

2. 瘦肉精检测方法有哪几种

（1）胶体金快速检测法将待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，待检物与金标试剂的结合物又与试纸条发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果，从而实现特异性免疫诊断。测试卡分析快速，仅需3～5分钟，无需专业人员操作，无需借助仪器，可以凭肉眼观察到结果，定性检测，测试卡可常温保存。
（2）酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其原理是利用抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，通过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）与克仑特罗（CL）结合，形成酶偶联克仑特罗。将固相载体上已包被的抗体与特异性的抗克仑特罗抗体结合，然后加入待测克仑特罗和酶偶联克仑特罗，它们竞争性与克仑特罗抗体结合，洗涤后加底物，根据有色物的变化计量待测克仑特罗含量。若待测克仑特罗多，则被结合的酶偶联克仑特罗少，有色物量就少。用目测法或比色法测定样品中的克仑特罗含量，比色法的最佳波长为450纳米。

3. 瘦肉精检测的检测

GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定
气相色谱-质谱法（GC-MS）
GC-MS法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。Fente C. A等用GC-MS法检测牛毛中CLB的残留，最低检测限为5ng/g；Pteer Batioens应用气相色谱－串联质谱法(GC-MS-MS)对牛、羊、猪组织中的CLB含量进行检测，最低检测限为2ng/g；刘琪等用GC-MS法（EI离子源）检测猪尿中的CLB，检测限为0.5ng/mL；VanRhijin等用三甲基硅基或2-二甲基硅基吗啉衍生物检测尿提取物中的CLB，衍生物用电脉冲方式或化学离子化方式扫描，会产生更高的灵敏度。另外，GC-MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低。因此，我国将GC-MS法定为检测CLB的确证性方法（NY/T468~2001）。
高效液相色谱法（HPLC）
HPLC适合测定热不稳定和强极性的β-激动剂及其代谢产物，而且，HPLC可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱(MS)等系统联用，容易实现分析过程的自动化。黄士新等(1995)应用紫外检测器，在λ=243nm，色谱柱：shimpackCLC-ODS150×6.0mn，流速：1mL/min，柱温：室温30℃的条件下检测猪肝脏和猪肉中的CLB残留，最低检测限可达2ng/g[4]。国外有人应用HPLC (二极管阵列检测器)测定动物性食品中CLB残留，测得最低检测限为1.26ng/g，回收率达98.9%[5]。目前，我国已将HPLC法作为检测CLB残留的半确证性方法，最低检测限范围为1～15ng/g，其优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳性率低；缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制。
酶联免疫吸附法（ELISA ）
利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，通过化学方法将植物辣根过氧化物酶（HRP）与克伦特罗（CL）结合，形成酶偶联克伦特罗。将固相载体上已包被的抗体（羊抗兔IgG抗体）与特异性的抗克伦特罗抗体结合，然后加入待测克伦特罗和酶偶联克伦特罗，它们竞争性与克伦特罗抗体结合，洗涤后加底物，根据有色物的变化计量待测克伦特罗量。若待测克伦特罗多，则被结合的酶偶联克伦特罗少，有色物量就少。用目测法或比色法测定样品中的克伦特罗含量，比色的最佳波长为450 nm，参比波长应大于600 nm。
胶体金免疫层析法（Colloidal gold immunochromatography）
利用竞争法胶体金免疫层析技术，检测液中的Clen与金标垫上的金标抗体结合形成复合物，若Clen在检测液中浓度低于灵敏度值，未结合的金标抗体流到T区时，被固定在膜上的Clen-BSA偶联物结合，逐渐凝集成一条可见的T线；若Clen浓度高于灵敏度值，金标抗体全部形成复合物，不会再与T线处Clen-BSA偶联物结合形成可见T线。未固定的复合物流过T区被C区的二抗捕获并形成可见的C线。C线出现则表明免疫层析发生，即试纸有效. 1. 在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将试剂板和待检样本溶液恢复至室温。
2. 撕开铝塑袋，取出试纸。
3. 依据型号进行操作（尿液不得直接浸湿观察区）。
3.1 将试纸白色一端浸入尿液中（液面不得超过横线），保持5秒钟；
3.2 用滴管吸取待检样品尿液，逐滴缓慢加入3滴样品于加样孔中。
4. 将试纸平放1分钟，等待红色条带出现。
5. 3～8分钟内读取结果，10分钟后判读无效。
6. 10分钟内可以检测出结果 阳性（+）：仅质控区（C）出现一条紫红色条带。在测试区（T）内无紫红色条带出现。
阴性（-）：两条紫红色条带出现。一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区（C）内。
无效：质控区（C）未出现紫红色条带，提示测试失败或试 纸已失效。
注意：测试区（T）内的紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判定为阴性结果。 1.检测卡请在保质期内一次性使用。
2.检测时避免阳光直射和电风扇直吹。
3.尽量不要触摸检测卡中央的白色膜面。
4.尿样滴管不可混用，以免交叉污染。
5.如果尿样出现沉淀或浑浊物，请离心后再检测。
液相色谱—质谱/质谱法（HPLC-MS/MS）
参见SN/T 1924—2007 进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法。
本标准适用于动物源性食品肌肉和内脏中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测。
试样中的药物残留采用pH5.2的乙酸铵缓冲液提取，同时加入β-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酯酶进行酶解后，提取液经C18和SCX双SPE柱净化，液相色谱—质谱进行测定，内标法定量。

4. 如何检测“瘦肉精”的残留

目前，检测“瘦肉精”残留的方法主要有四种，即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）。目前，我国将HPLC法作为“瘦肉精”检测残留的半确证性方法，其最低检测限范围为1～15纳克/克。IA技术主要有放射免疫分析技术（RIA）和酶免疫分析技术（EIA）。RIA最低检测限可达到0.5纳克/克，国外已生产出RIA测定克伦特罗的试剂盒。检测克伦特罗较高效的EIA是ELISA技术，检测限可达0.05纳克/克，最高可达0.003纳克/克。我国研制的“瘦肉精”多克隆抗体检测试剂盒，对样品检测的特异性强，检测时间短，可同时检测多个样品。

5. 通过检测猪的尿液能检测出瘦肉精吗

据广州市动检所介绍，目前业内采用的瘦肉精检测法有三种。

一种是试剂条，只要浸入尿样就可检测，因其成本低、操作简单，目前成为最广泛使用的初检法。试剂条单价7.95元，加上一次性接样器皿等，检测一头猪大约花费9元，能测出浓度3微克/公斤以上的样本，准确率达95%。

第二种检测法为，如果试剂条发现问题，再用“酶联免疫吸附试验”进一步确认。酶检法检测一头猪要花费22元，检测精度可达1微克/公斤。此外，酶检还可以直接检测生猪的肌肉、内脏。涉及纠纷时，如果货物量不大，用酶检可得到双方认可。

最后一种方法是使用“气相质谱仪”，这款仪器检测一头猪的成本为800元，每个样本要耗费四五个小时，一般只在涉及金额较大的纠纷时采用。

试剂条和酶检是市场普遍使用的方法，此前有生猪档主称，瘦肉精“只要停药一个月就测不出来”。但广州市动物卫生检疫监督所所长彭聪认为，如果此前生猪所含瘦肉精量大，排一个月也未必能躲过检测;如果本来含量就小，检测时浓度低于3微克/公斤，就可能检不出来。“不过这个浓度虽然对人体不好，但不会有什么症状。”彭聪说。

6. 动物肉中瘦肉精用什么方法检测

可采用试剂盒检测的方法。 检测方法简单易操作，无需专业技术知识即可操作。 采用优化选择液体提取剂及固体提取剂，可将样品中克伦特罗有效的提取出来并净化其中的杂质-用胶体金检测卡进行检测时，条带清晰，准确度高。特别适用于肌肉组织及饲料等样品的检测。 扩展 http://www.liujiaotishop.com/detail-195.html