中性树胶快速干片方法

❶ 细菌涂片怎么制作

实验准备材料：酒精灯、接种环、染液、载玻片、菌种、生理盐水等

步骤：

1.取一块干净无菌的载玻片，在载玻片中央滴一滴生理盐水。

(1)中性树胶快速干片方法扩展阅读：

实验注意事项：

1.接种环必须要圆滑平整，使用前后必须在酒精灯上烧灼灭菌。

2.注意做好实验过程记录，实验名称及日期。

3.涂片不要太厚，要均匀。

4.涂片固定时一定要把握时间和温度，避免温度过高引起菌体破坏。

❷ 200分求科研实验切片的操作

石蜡切片法 ：
石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.
石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定.
取材的注意事项如下:
(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料.
(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.
(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.
(二)固定
将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.
良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.
常用固定液:
简单固定液 以一种化学药品配制的固定液.
⑴ 乙醇 为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.
⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.
⑶ 醋酸 为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.
2. 混合固定液:
由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:① 优缺点互补;② 膨胀与收缩相互平衡;③ 强氧化剂与还原剂应分别配置.
常用混合固定液有下列几种:
⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.

⑵ 纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;主要用于显示分裂相.
(三)抽气
植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.
一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.
(四)洗涤
固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察;有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.
(五)脱水
材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.
脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分;在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料.
(六)透明
透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.
二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..
(七)浸蜡
是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.
浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.
每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.
(八)包埋
材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.
操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.
(九)切片
即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.
(十)贴片
是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.
常用的粘片剂有下列二种:
(1) 明胶黏片剂
(2) 蛋清黏片剂
(十一) 染色
即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.
染色方法可分为下列几类:
① 单染 只用一种染料染色.
② 双重染色 两种染料染色,如番红--固绿;苏木精---曙红.
③ 多重染色 多种染料染色,如番红—固绿—桔红G;酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.
(十二) 封藏
封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.
方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.
冷冻切片法：
冷冻切片的制作方法

（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法

1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

2．操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。

⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。

3．冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

4．冰冻切片的快速染色法

冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分钟。

② 水洗。

③ 染苏木素3－5分钟。

④分化。

⑤ 于碱水中返蓝20秒。

⑥ 伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。

冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。

❸ 请教巴氏染色的原理，越详细越好

巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。 分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水（50度温水最佳）变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用，EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。

巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色。

巴氏染色的操作方法及注意事项
染色有4个步骤：1、固定；2、核染色；3、胞浆染色；4、透明。
主要达到以下要求：1、核的结构清晰；2、透明度高；3、分色恰当。
一、固定
固定的目的细胞制片的迅速固定是制片过程中关键的一步，否则会影响细胞学诊断的准确性。对于不同的标本需要不同的固定方法。最为常用的固定方法是95％酒精作为固定液的湿固定法。酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内的酶捋蛋白质分解而自容，并凝固细胞内的物质如蛋白质、脂肪和糖类等，使其保持与组织生活相仿的成分，从而使细胞各部分，尤其核染色质易于着色。对于巴氏染色来说，酒精固定最为重要的。如果酒精浓度不足引起的固定不佳，可造成细胞的人为变化，并可导致假阳性或假阴性的诊断。
1、固定方法湿固定法：作为用95％酒精固定液固定的细胞学标本一定使用湿固定法。制片制备完后，趁标本新鲜而又湿润时，立即放入盛有95％酒精的固定缸内。制片在固定液内至少保持15-30min。固定时间通常不超过1周。这种制片染色后，颜色鲜艳，结构清晰。如果细胞制片需要送至另一实验室或邮寄他处染色时，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因为无论固定前或固定后的制片，如果发生干燥后都会影响染色的效果。
2、固定注意事项固定液的过滤：为了防止细胞污染，凡是使用过的固定液，必须过滤后才能再使用。使用过长的固定液，必须用酒精相对密度计测定，酒精浓度低于90％时应该及时更换新液。湿固定的重要性：标本再新鲜时及时固定时保证染色效果的重要因素。如苏木素对细胞核的染色，巴氏染色中胞浆的特殊着色作用，均可因标本干燥后固定而大受影响。制片标本的邮寄：标本再固定15min后取出，立即加甘油数滴于制片上，装入密封的小盒中。实验室在收到标本后，先浸入95％酒精中，使甘油溶去，再进行染色。
二、核染色
1、 苏木素液浸染时间一般在3-5min，但是必须随气温和燃料情况而酌情改变。夏季或放置较久的苏木素染液容易着色，时间要缩短；冬季或新配制的苏木素染液和应用已久较稀释的苏木素液不易着色，时间要延长。在使用苏木素染色时，一般有2种方法：
1）过染法：首先有意识地进行深染，然后通过盐酸酸化过程使核染色趋于合适。这种方法能够在酸化过程中把胞浆内黏附多余的苏木素染料去掉，使胞浆染色更为鲜艳、清晰、多用于黏液多的标本。
2）淡染法：在核染色过程中，严格掌握染色时间，使核染色适宜而不用盐酸酸化，但是胞浆中少量的苏木素会影响EA染色的质量。主要用于黏液少的标本，避免在酸化和自 来水冲洗的过程中使细胞成片地脱落。在使用苏木素染色时，一定要每日进行过滤，否则苏木素结晶会影响染色的质量。一般苏木素染液可以使用较长时间，所以每日增加少量新鲜染液即可。
2、碱化碱化亦称返蓝过程，可以使用饱和碳酸锂或3％氨水碱化，目的使苏木素及早显色，时间约数秒。更重要的是流水冲洗，可使蓝色显的更鲜艳。碱性溶液亦需要充分漂清才不会妨碍下一步的胞浆着色及标本制成后的颜色保存。分化和碱化溶液至少每天更换新液。
三、胞浆染色
胞浆染色在巴氏方法中亦称为OG—EA染色，它包括橘黄G（OG）和EA两部分染色。由于橘黄G是一种小分子染料，能够很快地作用于胞浆，一般染色时间不宜过长，通常1-2min。对于宫颈、阴道上皮中非正常角化细胞和角化型鳞癌细胞的胞浆中都可以出现鲜艳的橘黄色。
四、封固制片
封固制片对于避免空气干燥的影响，制片经长期存放不褪色是非常重要的。一般使用24mm×50mm或24mm×60mm的盖玻片，用二甲苯调配的中性树胶进行封固。
五、透明
染色的最后一步是透明，使细胞的色度与细胞的重叠不致影响镜下检查。这是在脱水与制片封固之间的一项重要步骤。最常用的透明溶剂使二甲苯，二甲苯的折射率在1.494，载玻片的折射率在1.515，两者较为匹配。如果二甲苯溶液出现颜色或变得浑浊，一定要更换新液。 巴氏染色操作流程 95％乙醇固定（15min）→清水冲洗多次→苏木素染液（3-5min）→清水冲洗三次→蓝化→95％乙醇漂洗→橙黄染液（1-10s）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→100%乙醇漂洗→EA50（3-5m）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→无水乙醇漂洗→无水乙醇（2min）→二甲苯（2min）→中性树胶封片
染色注意事项
1、细胞核着色不佳
（1）细胞核着色过浅：
1）盐酸分化时间过长或苏木素染液时间过长。需要缩短分化时间或延长碱化时间；每日加入少量新鲜苏木素染液或重新配制苏木素液。
2）在固定之前制片干燥。所以对巴氏染色的制片需要严格遵守湿固定的原则。
3）自来水的PH值偏酸性。使用碱性溶液。
（2）细胞核着色过深：
1）盐酸溶液浓度不够。适当加入几滴盐酸以增加浓度。
2）制片用高于95％以上浓度的酒精固定后可以出现染色过深。应用95％酒精固定。
2、细胞浆着色不佳
（1）如果全片内胞浆都淡染，则需要延长染色时间或更换新液。
（2）如果胞浆不分色，均为浅红色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌样细菌影响胞浆染色。此情况可以适当增加染色时间能够部分纠正不分色状况。
（3）胞浆染成灰色或紫色，是由于苏木素染色时间过长或盐酸分化不佳。经过褪色后重新苏木素可以纠正。
（4）由于标本的不同，同样配方的EA染液可造成偏蓝、偏绿和偏红，对不同的标本应该使用不同的EA染液。一般认为，EA36和EA50用于妇科标本，而EA65或改良EA用于非妇科标本。
（5）胞浆不分色的另一重要原因是由于EA染液的PH值不恰当所致。如染色为红色，可以加少许磷钨酸溶液纠正；如染色均为蓝色或绿色，可以加少许饱和碳酸锂溶液纠正。对于改良EA染液，每100ml染液加入2ml冰醋酸后染色效果更佳；染液使用更持久