培养病毒的方法和技巧

Ⅰ 怎样培养流感病毒

1 用于培养流感病毒的细胞1󰀁1 细胞株的选择 在最初培养流感病毒的时候用鸡胚,但鸡胚分离流感病毒容易引起病毒便变异和过敏性反应,还存在大规模生产时外源病毒的污染问题。而运用Vero和MDCK细胞培养流感病毒不但解决了上述问题,还使得病毒的免疫原更稳定。戚凤春[1]等人研究发现,相同的实验条件下,在MDCK细胞上培养的病毒HA滴度明显高于Vero细胞,因此我们培养流感病毒细胞株的选择MDCK细胞,其代数最好小于35代,细胞过老会使病毒不容易负载。 1󰀁2 细胞最佳负载病毒的胞龄 MDCK细胞繁殖非常旺盛,必需只能提前一天将细胞培养瓶里的细胞接种在六孔板中,如果负载病毒用胞龄为两天的MDCK细胞,那么病毒培养的阳性率几乎为0,而胞龄为12-24h的MDCK细胞对病毒的负载阳性率禅闷区别不大[2]。1󰀁3 细胞负载病毒的最佳密度 首先,MDCK细胞的密度不能太稀,这种细胞密度太稀则不能生长,也不能让细胞密得堆积起来,那样也会很大程度降 低病毒接种的阳性率。最好使细胞刚刚铺满孔,这时负载病毒后收获病毒的HA滴度最高。当工作人员提前一天将细胞接种在6孔板中时,应考虑细胞的生长速度,使其第二天负载病毒时的细胞密度适当。其次,MDCK细胞接种六孔板时要密度均匀,容易出现的情况是细胞都聚集在孔的边缘,而中间密度过稀,这样也会影响病毒负载的阳性率。避免这种情况出现就要工作人员手法熟练,如果出现了这种情况,将培养板轻轻晃动(避免液体溅出),能有效改善细胞的分布。2 培养流感病毒的试剂 用于培养流感病毒试剂的不同也会很大程度影响病毒培养 阳性率。首先,不使用过期的试剂;其次,最好使用知名厂家的试剂,比如GIBCO等;再次,使用前将试剂从冰箱拿出一段时间,最好等试剂的温度已经平衡到室温再用。如果是给细胞换代,过冷的试剂会影响细胞的生长状态;如果是负载病毒前洗细胞用,过冷的试剂会使细胞突然皱缩而病毒培养的阳性率。3 样品 3󰀁1 样品的存放 样品存放的时间直接影响病毒负载的阳性率,标本越新鲜,病毒培养的阳性率越高。如果样品不能及时负载细胞,应将样品放在-70!冰箱中,避免反复冻融,冻融次数越多,病毒培养的阳性率越低。注意不能将样品放在-20!的冰箱中,流感病毒在-20!非常不稳定,如果当天的样本要第二天才能接种,应将样品放在4!冰箱中。3󰀁2 样品的无菌处理 因为样品的采样条件不可能无菌,虽然采样液中有抗生素,也不能保证细菌全被杀死,所以阳性样本最好过滤到无菌的1󰀁5ml离心管中备用。有些工作人员采用往细胞培养板中加抗生素避免污染,这样虽然省事,但会对细胞有伤害,从而降低了病毒培养的阳性率。4 病毒负载的操作步骤4󰀁1 细胞洗涤 将六孔板中的细贺纯弯胞培养液倒去,用HBSS洗涤每一孔三遍以上,其作用是洗去残留的FBS,FBS通过抑制胰酶而抑制流感病毒的复制。将洗液倒去后,应立即加入洗液或病毒液,过长时间将细胞暴露在空气中将很大程度降低病毒培养的阳性率,最好将细胞暴露在空气中的时间缩短在5秒以内。4󰀁2 病毒液的接种量 病毒液的接种很有讲究。负载在细胞上的病毒液应大于300u,l否则不够盖过整孔细胞。待37!孵育1~2h后,不管开始负载了多少体积的病毒液,都应在每孔留300ul病毒液再加入病毒培养基,若病毒液全都弃去或留得太少,会使病毒培养阳性率大打折扣;若病毒液留得太多,比如超过400u,l也会使阳性率降低很多,因为存留过多的缺损病毒会严重影响正常病毒的复制。4󰀁3 病毒液的孵育时间 理论上,病毒液在37!孵育1~2h都可以,但我们发现1h还是太短,最好在1h15min加入病毒培养基,不要时间过长,那样也会使病毒培养的阳性率降低,可能是因为采样液的pH值和病毒培养基不同,孵育时间稍长导致细胞受到损伤。而盲传的时候,孵育的时间可以到2h以上,因为这时候所用的病毒液也是病毒培养基,而不是采样液。4󰀁4 病毒培养基的配制 病毒培养基是用DMEM加入HEPES和胰酶配制而成的,HEPES的作用是加强体系的缓冲能力,胰酶的作用是将病毒粒非裂解型的HA0变成裂解型的HA1+HA2,从而提高流感病毒在细胞中的复制能力,因为流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性。但是裤缓HEPES和胰酶在DMEM在4!共存时间过长会引起pH值上升,所以病毒培养基我们一般都是现配现用。 4󰀁5 病毒HA滴度的测定 CPE出现时间随病毒的型别和毒株的差异以及感染量的大 小而异。我们将标本接种后3d观察是否出现CPE,出现CPE的测定HA滴度,滴度大于8则收获病毒,用HI实验测定病毒亚型,病毒滴度小于8进行盲传,再在第3d测定HA滴度。若负载病毒7d还不出现CPE,维持液中又查不出HA活性,可认为阴性标本,弃之。3d时间出现病毒滴度的 最高峰, 4d和2d都低于3d时病毒的滴度。收获毒株前,将 细胞于-80!/37!冻融一次,有利于增加病毒的HA滴度。

Ⅱ 病毒学研究的基本方法有哪些

（一）生物学特性测定：在寄住上的反应——症状、传播等；
（二）病毒分离与培养：提纯与纯化，二元培养法；
（三）光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异性免疫吸附情况；
（四）免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况，多克隆抗体，单克隆抗体；
（五）分子生物学技术：核酸分子杂交，PCR等。

Ⅲ 怎么培养病毒和疫苗

疫苗现在有灭活疫苗，减毒活疫苗，基因工程疫苗等等，和病毒培养有直接关系的，就是灭活疫苗，减毒疫苗。病毒培养一般都有最适培养条件，不同病毒适合在不同的细胞上生长。例如狂犬病疫苗，可以将弱化的狂犬病毒在BHK21、VERO细胞上培养，首先把细胞培养好，然后接入病毒，当病毒达到最高滴度时，将病毒灭活后纯化就是灭活疫苗。直接冻干后 就是减毒活疫苗。

Ⅳ 培养流感病毒的方法有哪几种

鸡胚传代培养、MDCK细胞培养、本动物回归培养。

Ⅳ 目前最常用的培养病毒的方法是哪种

1.动物接种
这是最原始的病毒培养方法。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。
2.鸡胚接种鸡胚对多种病毒敏感。根据病毒种类不同，可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜上。
3.组织培养
将离体活组织块或分散的活细胞加以培养，统称为组织培养。组织培养法有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养。细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源，染色体特性及传代次数又可分为下列类型：原代和次代细胞培养，二倍体细胞株和传代细胞系。

Ⅵ 病毒的培养方法有哪几种

(1)动物接种：顷裤按病毒种类不同，选择易感动物并接种于恰当的部位雀备简。
(2)鸡胚培滚带养：一般采用孵化9～14天鸡胚，按病毒种类不同接种于鸡胚的不同部位。
(3)组织细胞培养：将病毒接种于离体的组织块或单个的细胞内培养

Ⅶ 目前病毒分离培养最常用的方法是

一般来说病毒培养的方法有三种 一是动物接种 常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。二是鸡胚接种 鸡胚对多种病毒敏感。根据病毒种类不同，可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜。第三是组织培养 将离体活组织块或分散的活细胞加以培养，统称为组织培养。组织培养法有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养。细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源，染色体特性及传代次数又可分为下列类型：原代和次代细胞培养，二倍体细胞株和传代细胞系。 最常用的应该是细胞培养。

Ⅷ 细菌和病毒的培养方法

1繁殖方式:前者复制,后者二分裂；生活方式:前者寄生,离开宿主细胞无法生活,且对宿主有害,后者可寄生,腐生或自生,寄生时可能对寄主有益也可能有害；结构:前者无细胞结构,后者有；遗传物质:前者是DNA或RNA,后者只有DNA；变异速度:前者特别是RNA病毒变异速度极快,后者较为缓慢,突变率低.2培养基制作过程较繁琐,自己找相关资料.3病毒利用特异性的宿主,培养基中营养条件取决于宿主,细菌利用特异性的培养基,营养条件取决于自身.4.同2.5.寄主是否有相应的抗原；环境条件是否适宜；是否有一定的群体使大量细胞死亡,从而使器官失去相应功能.6外毒素:由细菌所分泌、能在局部及全身产生毒性效应的蛋白质成分.
内毒素:只在细菌被破坏时才被释放的细菌毒素.
类毒素:由于变性或化学修饰而失去毒性的毒素,但仍保留其抗原性.
7.特异性的培养基分别筛选,不同菌种有不同的鉴定方法

Ⅸ 病毒的培养方法有哪些为什么不能用一般培养基来培养病毒

适龄鸡胎接种，传代培养，组织细胞培养，易感动物接种。不可以。病毒是寄生在活体上的生物，而培养基是没有生命的有机物或无机物，病毒在上面不能生存。
病毒的结构是有一个DNA，和蛋白质外壳，和其它功能性的附属结构。
病毒不能自己生产蛋白质，它只有在寄生在活体上之后，把自己的DNA，注入到寄主细胞内，和寄主DNA结合，然后表达，利用寄主的蛋白质、DNA的和成功能，和成自己的蛋白质外壳，DNA，然后这些DNA和外壳在及主细胞破裂之后溢出，重新组合成好多病毒，感染其它细胞或寄主。 可以看出，这个细胞必须有生命（新陈代谢，能合成蛋白质DNA等），培养基是不行的。

Ⅹ 病毒的人工培养方法

病毒研究的发展常常与病毒培养和检测方法的进步有密切的关系，特别在脊椎动物病毒方面，小鼠和鸡胚接种、组织培养、超速离心、凝胶电泳、电子显微镜和免疫测定等技术，对病毒学的发展具有深刻的影响。

噬菌体的培养和检测方法最为简单。将噬菌体接种到易感细菌的肉汤培养物中，经18～24小时后，混浊的培养物重新透明，此时细菌被裂解，大量噬菌体被释放到肉汤中，再经除菌过滤，即为粗制噬菌体。为了测定其中噬菌体的数量，将粗制噬菌体稀释到每一接种量含100个左右，与过量的细菌混合，然后铺种于琼脂平皿上，在温箱中培养过夜，细菌繁殖成乳白色衬底，被噬菌体裂解的区域则在此衬底上表现为圆形的透明斑，称为噬斑。噬斑数代表该接种量中有活力的噬菌体数量。如果挑出单个噬斑来培养，就能获得由单个噬菌体所繁殖的后代，达到分离纯化的目的。

动物病毒（见脊椎动物病毒）的培养可在自然宿主、实验动物、鸡胚或细胞培养中进行，以死亡、发病或病变等作为病毒繁殖的直接指标，或以血细胞凝集、抗原测定等作为间接指标。收获发病动物的组织磨成悬液或有病变的细胞培养液，即为粗制病毒。测定活病毒数量可采用空斑法，其原理与噬斑法相同，但以易感的动物单层细胞代替细菌，在接种适当稀释的病毒后，用含有培养液和中性红的琼脂覆盖，使病毒感染局限在小面积内形成病变区，衬底的健康细胞被中性红染成红色，病变区不染色而显示为空斑。

至今植物病毒的培养和检测大都是在整株植物上进行的。从捣碎的病叶汁中制备病毒，常用枯斑法检测。用手指蘸上混有金刚砂的稀释病毒在植物叶片上轩轻摩擦，经一定时间后出现单个分开的圆形坏死或退绿斑点，称为枯斑。

除了利用病毒的致病性定量检测病毒外，还可应用物理方法，如在电子显微镜下计数病毒颗粒，或用紫外分光光度计测定提纯病毒的蛋白和核酸量，这些方法所测得的数据包括了有感染性和无感染性的病毒粒。

应用电子显微镜不但能看清病毒粒的大小、形态，还可以分辨其表面的蛋白亚单位和内部的核壳等超微结构。