dna如何用物理方法导入细胞

① 将外源基因导入原核细胞或真核细胞分别有哪些方法

1 物理方法
1.1 DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但注入量有限, 能够接触到的肿瘤细胞有限,故获得的肿瘤细胞转化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
1.2 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从而提高肿瘤细胞的转化率。
2 化学方法
即用化学方法构建非病毒载体系统，借之完成基因转导。主要包括以下两种。
2.1 脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一种有价值的体内基因转移方法。多用于体外转化细胞，或通过瘤组织内注射〔1〕进行体内转化,并已有少数临床应用的报告。目前常用的是阳离子脂质体(商品名为Lipofectin)。它可自发的与DNA形成复合物，保护外源DNA不被核酸酶降解，具有制备简单、安全无毒、无免疫原性、重复性、对基因片段大小无限制且转染操作方便等优点。由于它可与细胞膜直接融合而能有效地避免溶酶体破坏，故远比传统的脂质体效率高。缺点是靶向性有限。Nishikawa等〔2〕从BALB/c小鼠的尾静脉注射以荧光素酶基因为报告基因的质粒DNA-脂质体复合物， 发现肺、肝、脾等器官组织中都有荧光素酶基因及其产物，持续表达超过3个月。常规脂质体易被网状内皮系统(RES)细胞摄取，在巨噬细胞本身可成为靶细胞的部位，RES的这种亲合性是有利的。Hasegawa等〔3〕采用日本血凝病毒( hemagglutinating virus of Japan , HVJ)脂质体为载体，用HSV-tk/Gcv系统治疗肝癌发现，在体外试验中当Gcv的浓度100microg/ml时几乎所有肿瘤均被杀死，甚至当转导率只有20％时，也有1/3肿瘤被消灭。此方法重复应用效果更佳，且皮下注射未见明显的炎症反应。
2.2 受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。此法靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂，表达效率低下。利用氯哇抑制溶酶体酶或腺病毒与内吞小泡相融合而将其破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
3 生物学方法
主要通过构建病毒载体来完成。
3.1 逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低，且其随机整合有引起“插入性突变”的可能〔4〕。
3.2 腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因治疗中报告最多的一种病毒载体〔5〕。体外制备滴度较大 ，装载外源基因容量最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引起宿主免疫反应而使转染效率下降，且大剂量静脉给予可导致严重的肝脏炎症反应，因此通过全身给药受到限制。Nagao等〔6〕发现瘤内注射重组Adv后，目的基因可有效表达，但表达时间短暂，重复注射后表达效率降低且诱发体液和细胞免疫反应。
3.3 单纯疱疹病毒：单纯疱疹病毒(herps simplex virus，HSV)对非分裂细胞有天然的亲合力，装载外源基因容量达30kb，体外制备滴度接近腺病毒。但构建时难以除去与裂解细胞有关的基因而对细胞毒性大〔7〕。
3.4 腺相关病毒：腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)在人类不引起任何病理性后果，它能感染非分裂S相细胞，还能将基因转人非周期(noncyling)肿瘤细胞。AAV是一种缺陷前病毒，对人类无致病性。能用于运载外源性重组基因组，已应用于肝和肝癌细胞的治疗基因转移〔8〕。
3.5 其他病毒：痘苗病毒〔9〕(vaccini virus)可以独立在细胞之中复制和转录，并能以较强的方式表达多个肿瘤抗原。杆状病毒〔10〕(bacul virus)能够感染肝细胞和肝肿瘤细胞，并能增强肝细胞肿瘤坏死因子a(TNFa)、IL-1a、IL-lβ的表达。

② .还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞各有什么优缺点

物理方法：DNA直接注射法、颗粒轰击技术；
化学方袭亏法：即用化学方法构建非病毒载体系统,借之完成基因转导.主要包括：脂质体载体、受体介导法.
生拍告神物方法：主要通过构建病毒载体来完成.包括：逆转友李录病毒、腺病毒、 单纯疱疹病毒、 腺相关病毒、 其他病毒等.
具体介绍和优缺点等可以参考网络词条基因导入.

③ DNA是如何一步一步折叠进入细胞核中的

DNA先围绕组蛋白,200bp形成一个核小体,6个核小体形成一个环,组成螺线管,螺线管进一陪棚步折叠闭乱穗成超螺线管,超螺线管再缠绕,形成染色体
染色体长度比DNA浓缩上万倍,节轿卜省体积
平时DNA是以染色质形式存在的
DNA本来就在细胞核中,无所谓”折叠入细胞核中“

④ 哪些物理学方法能把外源基因导入受体细胞

1、获取目的基因? 2、形成重组DNA分子? 3、将重组DNA分子导入受体细胞? 4、筛选含有目的基因的受体细胞? 5、目的基因表达工具：限制性核酸内切酶（切割磷酸二酯键）、DNA连接酶（链接磷敏尘酸二酯键）、载体（主? 要为质粒、原核小型环状DNA）获取目的基因：若序列已知则用PCR扩增或化学方法合成：若序列未知则建立基因文库，从中获取形成缓毕重组DNA分子：用同一限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因形成相同的粘性末端，再用目的基因链接将重组DNA分子导入受体细胞：若受体为动物用显微注射法：若受体为植物用农杆菌转化法或花粉管法：若受体为微生物用氯化钙处理法（增加细胞壁通透性）筛选含有目的基因的受体细胞：利用载体上的标记基因进行筛选目的基因表达：个体水平上的性状，分子水平上的相应蛋白质桥哪禅、mRNA

⑤ 什么是DNA直接转化系统

DNA直接转化系统不依赖致瘤土壤杆菌载体或其他生物载体，将经处理的DNA通过物理的和化学的方法导入植物细胞，而实现遗传转化。

1.化学法

化学诱导DNA直接转化是以植物原生质体为受体，借助于特定的化学物质诱导DNA直接进入植物细胞，主要有下述两种方法。

（1）PEG介导法：PEG（polyethyleneglycol）即聚乙二醇，可在细胞膜之间或在DNA与膜之间形成分子桥，致使相互接触和粘连，诱导原生质体的内吞作用，摄取外源基因DNA。PEG法由Davey等（1980）建立，该法不一定需要克隆的基因和特定的载体，能实现控制数量性状的基因和在缺乏受体筛选标记条件下的遗传转化，但必须以裸露的原生质体为受体，某些植物建立原生质体再生系统较为困难，使PEG法的应用受到限制。

（2）脂质体法：脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构。用脂质体包裹DNA成球状，通过原生质体的吞噬或融合作用而将它转运到原生质体内部。包裹在脂质体内的DNA可免受DNA酶的降解。脂质体法可直接转化外源DNA和RNA，亦可用于基因的瞬时表达检测。2.物理法

物理法以植物原生质体、细胞、组织或器官为受体，以一些物理因素作用于细胞膜而直接导入外源目的基因DNA。

（1）基因枪法：又称微弹轰击法（particlebombardment），已有广泛应用。将外源DNA包裹在微小的金粒或钨粒表面，用基因枪（genegun）高速射入受体细胞或植物组织，微粒上的DNA进入细胞后，整合到染色体上得到表达，转化的受体几乎包括了所有具潜在分生能力的细胞与组织。基因枪法的转化率一般为10-3～10-2。该法可将外源基因导入植物细胞的细胞器，并可得到稳定表达。利用基因枪法能否成功，关键在于能否从转化细胞再生出可育的植株。基因枪还特别适于细胞器（叶绿体、线粒体）的基因转化，以及用于研究组织特异性启动子。基因枪法成本较高，操作比较复杂，难以插入外源DNA大片段，且整合的外源基因通常是多拷贝的，这可能导致植物自身某些基因的非正常表达，还容易发生基因沉默现象。

（2）电激法：利用高压电脉冲作用在原生质体上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，摄入外源目的基因。这一方法已成功地应用于多种单子叶植物和双子叶植物。

（3）激光微束法：将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射细胞后，利用其热损伤效应，在细胞壁上产生可恢复的小孔，直径只有0.5～0.7μm，使加入到细胞培养基里的外源基因得以进入植物细胞。该法操作简便、受体类型广、无作物限制，但转化率低，一般仅为10-4～10-3。

（4）超声波法：利用低声强脉冲超声波的生物学效应，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。该法有操作简便、设备便宜、不受作物种类的限制等优点，但尚需进一步完善。

（5）显微注射法：利用显微注射仪将外源基因直接注入到已固定的植物细胞核或细胞质中，实现基因转移。受体最初仅用原生质体，现可用于带壁的悬浮细胞、花粉粒、卵细胞、子房等。

⑥ 重组DNA分子导入受体细胞的主要方法有哪些

（1）农杆菌转化法：

农杆菌是土壤中的一种微生物，在自然条件下感染双子叶植物和裸掘渣孙子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。农杆菌进入梁姿植物细胞后，其Ti质粒上的T-DNA会转移到受体细胞染色体的DNA上，目的基因进入植物细胞。

（2）花粉管通道法：

在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

（3）基因枪法：

基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而判链实现稳定转化的目的。

原理：

选择一种特制的空质粒载体（如PBI121质粒载体），其上要求含有T-DNA边界序列（此处可参见词条双元表达载体系统），在序列之间含有复制原点、抗性基因、GUS报告基因、Hind Ⅲ和BamH I 等酶切位点（以上这些构成了一个T-DNA区）。

先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。

以上内容参考：网络-农杆菌转化法

⑦ 将dna分子导入细菌细胞的方法有哪几种

主要方法：
【1】导入植物受体细胞：
（1）农杆菌转化法。
农杆菌是土壤中的一种微生物,在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力.农杆菌进入植物细胞后,其Ti质粒上的T-DNA会转移到受体细胞染色体的DNA上,是目的基因进入植物细胞晌做。
（2）花粉管通道法：
在授粉后向子房含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
（3）基因枪法：
该法又称源前粒子轰击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment)，是由美国Cornell大学生物化学系John.C.Sanford等于1983年研究成功。主要适用于单子叶植物。但转化效率较低。
基因枪根据动力系统可分为火引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。

【2】导入动物受体细胞：
显微法：显微法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量针，将外源基因片段直接到原核期胚或培养的细胞中，然后借由宿主基因组序列可能发生的重组（rearrangement）、缺失（deletion）、复制（plication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。

【3】导入微生物受体细胞
感受态法：先用Ca离子处理细胞,使雹谨清细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态,这种细胞为感受态细胞,后将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中,在一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子

⑧ DNA重组体是怎样引入受体细胞的

重组体DNA分子只有导入合适的受体细胞，才能进行大量地复制、扩增和表达。

受体细胞有多种，如原核生物的大肠杆菌细胞、低等真核细胞生物如酵母、高等真核生物（如植物细胞、哺乳动物细胞）等都可用于转化的受体。胰岛素基因工程就是将外源DNA导入原核细胞大肠杆菌中进行表达实现的。选定的受体细胞必须具备使外源DNA进行复制的能力，而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多，如常用的重组质粒大肠杆菌热激转化法、病毒DNA感染法、生物介导法等。

在理想情况下，上述重组载体进入受体细胞后，能通过自主复制而得到大量扩增，从而使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状，受体细胞就成了“工程菌”。

⑨ 将目的基因导入受体细胞的方法有哪些

• 常用方法：基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。其中，对于细菌或植物细胞，常用质粒作为载体将目的基因导入细胞内；动物细胞则用显微注射的方法将目的基因导入动物受精卵的雄性原核中。

• 过程：用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如，如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。

⑩ DNA是怎样进入细胞质里的

根据细胞学所掌握的事实：所有DNA都呆在细胞核内，而蛋白质纤蚂却存在于细胞质中，像DNA这样的大分子是无法随意进入细胞质的。然而密码总是会被带入细胞质的，这一来，人们不禁要问，是谁把锁在细胞核内的DNA手里的密码带入了细胞质的呢？科学家们从DNA那里拷贝了一份密码文件，并带入了细胞质中。经过试验和观毁枯埋察，发现这个信使就败樱是RNA——核糖核酸。