如何对检验方法验证

‘壹’ 求助：检验方法验证或确认的风险评估

对于生产工艺而言，采取有效手段监测日常生产中有可能发生的，与经过验证的产品注册工艺的偏离，并评估是否有必要采取措施加以预防或纠正，确保工艺处于监控中；持续收集和分析日常生产中与产品质量相关的工艺数据以判断产品的关键质量属性在整个工艺过程中受控状况；通过产品质量年度回顾对质量缺陷投诉、OOS数据、偏差、收率波动等变化情况进行趋势分析并评估工艺过程是否处于受控状态。
对于厂房、设施、设备而言，通过日常例行监测、维护与校验程序及计划与实施来保持确认状态；通过对日常获得数据与设施及设备确认数据的定期评估确定是否需要再确认或再确认的程度。
对于清洁而言，验证状态的维护应包括环境监测数据趋势分析；必要时对与物料直接接触的设备表面进行残留物检测（新版GMP第197条-六）；设备（包括被清洁设备和用于清洁的设备）的预防性维护和校准等。
总之，应采用风险管理的原则，根据实际需要选择验证状态维护工具。
新版GMP第一百四十条特别强调了确认与验证的实施要有文件、有记录、有目标。明确要求厂房、设施、设备的设计要符合预定用途及GMP要求，建造安装要符合设计标准，运行符合设计标准，在正常操作方法和工艺条件下其性能可持续符合标准；生产工艺按规定参数能持续生产出符合预定用途和注册要求的产品。
设计确认（DQ）是新的或改造的厂房、设施、设备验证工作的第一步，内容主要包括为了确认设施、系统和设备的设计方案符合期望目标所作的各种查证工作及文件记录。
按照新版GMP《确认与验证》附录规定，企业首先需要以文件的形式向供方提供“用户需求说明（即URS）”。
通俗地说，客户需求文件（URS）就是设计确认的检查标准。它是验证工作获得成功基础，有了URS才能有目标地展开验证活动。
在给供应商提供的URS中，企业要立足于产品与工艺需要，明确提出自己对厂房、设施、设备等的使用要求（预定用途）以及其它相关法律法规符合性要求。尽而对供方所“提供”的厂房、设施、设备设计方案及说明性资料进行预审查，避免设计失误造成无法弥补的先天性缺陷。
经生产质量等相关负责人审核、批准的用户需求说明（URS）应尽可能做到：每一个需求都有具体的标准；每一个需求都能够通过测试或确认来证实供方提供的实物是否满足自己的需要；每一个需求都清楚明确而且是能够实现的；每一个需求都通过设计和测试进行追踪。
在进行设计确认时，要重点关注与质量相关的关键点。如材料材质、安全评估、环保问题、空间要求、使用要求；设计是否易于清洗/清洁与检查；是否引入有害的物料及需要更换的部件等。
目前，还没有一个行业内普遍认可的设计确认模式。实际工作中，如果从项目实施开始就按照国家关于医药建筑、设备等的相关规定操作，将满足这些规定的全套资料保存下来，就基本符合了新版GMP对设计确认的检查要求。如果设备是定制的话，则更需要加强设计确认。
另外，在设计确认阶段应强化变更管理，对原设计的任何变更都要进行记录，并对相关因素作出适应性调整。
安装确认（IQ）是为了证明新的或改造的厂房、设施、设备达到设计要求而进行的各种系统检查及将技术资料文件化的工作。
企业应当根据用户需求和设计确认中的技术要求对厂房、设施、设备进行验收并记录。安装确认至少包括：根据最新的工程图纸和技术要求，检查设备、管道、公用设施和仪器的安装是否符合设计标准；收集及整理（归档）由供应商提供的图纸、设备清单、各类证书及材质证明、说明书或操作与维护保养手册；对相应的仪器仪表进行必要的校准；工程技术人员根据供方提供的技术资料结合本企业实际情况，起草操作、清洁、校准和维护保养等标准操作规程。
运行确认（OQ）是为了证明新的或改造后的厂房、设施、设备能在设计要求预期的范围内正常运行而作的试车、查证及文件化工作。
运行确认至少包括：根据设施、设备的设计标准制定运行测试项目；试验/测试应在一种或一组运行条件之下进行，包括设备运行的上下限，必要时采用“最差条件”进行确认，而且测试要重复足够的次数以确保结果可靠；操作、清洁、校准和预防性维护保养等操作规程应在运行确认过程中进行修改和完善，并对相关人员培训。
安装确认与运行确认一般可以由供应商与企业共同完成。完成了运行确认相当于允许厂房、设施、设备正式“放行”使用。
性能确认（PQ）是为了证明已安装连接的厂房、设施、设备能够根据批准的生产方法和产品的技术要求有效稳定（重现性好）运行所作的试车、查证及文件化工作。
性能确认是使用生产物料、经确认的替代品或模拟产品，对每一个关键控制系统（如温度控制、压力控制和搅拌控制等）和所有影响产品质量的关键参数（如温度、压力和搅拌速度等）进行的测试。性能确认方案内容包括参数介绍、测试条件和方法、测试的频率及其标准等，应当评估测试过程中所需的取样频率。
在性能确认阶段，对于制剂产品而言，为了证实设备能够满足商业化生产的能力，会在正式生产之前生产一些空白产品。而对于原料药来讲，很难在生产中使用所谓的空白物料。有些公司会运行溶剂或水来模仿原料药工艺（以水代物料，与试车工作相结合）。也可以采用投入正规生产时所用物料进行性能确认，将该批次产品同时定义为工艺验证批和设备性能确认批（企业承担批次失败所带来的经济损失风险）。
确认工作过程要有逻辑性和系统性，一般均为先向供方提出URS，然后是DQ、IQ、OQ、PQ。在某些情况下，可以考虑采用性能确认和运行确认或工艺验证结合进行的方式，但应有充分的说明，性能确认过程的取样频率需要评估。
厂房与设施（含空气净化系统，压缩空气系统、制水系统等）应先于设备进行确认，设备确认应在投入正常生产前完成，因为生产设备应当在确认的参数范围内使用（见新版GMP第八十三条）。与确认相关的文件记录包括标准操作规程、可接受标准、操作手册等。确认应按照已批准的方案进行，确认结果应记录并反映在确认报告中。
如果确认对象是已经在使用的，应针对实际现状予以确认：进行安装现状检查（IQ）、设备运行参数检查测试（OQ）、与工艺匹配性测试评估（PQ）即可。
确认是工艺验证的先决条件，厂房、设施、设备的确认应列入验证总计划中。
工艺验证（PV）的主要目标是认定所设计的生产工艺按照规定的工艺参数能够持续生产出符合预定用途和注册要求的产品。
药品上市销售前必须完成并达到设定要求的工艺验证。新版GMP特别强调采用新的产品处方或生产工艺前应当验证其常规生产的适用性，以确保“能够始终生产出符合预定用途和注册要求的产品”（见第一百四十一条）。这里的“预定用途和注册要求”，即指药品疗效、安全性和质量标准的符合性。
工艺验证首先基于从研发过程中获得的对产品和工艺知识的理解，以重点识别和关注产品的关键质量属性（可从鉴别、理化性质、性状、含量、纯度、粒度、微生物限度、晶型等方面考虑）、关键工艺参数、常规生产和工艺控制中的关键工艺参数范围。采用新的生产处方或生产工艺进行首次工艺验证应当涵盖该产品的所有规格。

‘贰’ 验证方法学有哪些

所谓方法验证，就是对分析方法进行验证，以证明其符合检测的目的和要求。再解释得直白些，就是根据检测项目的要求，先设置好验证内容，通过设计合理的试验以验证所采用的的分析方法符合检测项目的要求。

要保证控制产品质量，那么方法验证必不可少。只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，可以说，方法验证是指定质量标准的基础。

那么方法验证内容包括哪些方面呢？其验证要求又是什么呢？

1、线性。线性是指在设定的范围内，检测结果与样品中原料或产品浓度呈线性关系的程度。线性是定量检测的基础，需要进行定量检测的项目都要验证线性。一般用贮备液经过精密稀释，或者分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，用峰面积和浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。

2、准确度 。准确度是指测定的结果与真实值之间的差距程度，也可以叫做真实度，需要定量的分析方法都需要验证准确度。准确度必须在规定的范围内建立，对于原料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原料药进行测定，必要时还可以和另一个已建立准确度的方法比较结果。

3、检出限。检出限是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，不需要准确定量。检出限代表分析方法的灵敏度。检出限的测定可以通过对一系列已知浓度被测物的试样进行检测，以能准确、可靠检出被测物的最小浓度来确定，也可把已知浓度样品的信号与噪声信号进行比较，以信噪比为3：1时的浓度确定检出限，一般要求能够达到进样浓度的0.05%。

4、耐用性 。耐用性是指测定条件发生小的变动时，测定结果的稳定程度。耐用性主要表明方法的抗干扰能力，主要的变动因素包括：流动相的组成、流速和pH值、色谱柱、 柱温等 。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，从而确保方法有效。

5、专属性。专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称作选择性。对于纯度检测，可在标准品中加入已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰值是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。必要时可以使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。一般来说，要求产品和杂质之间的分离度大于2.0。

6、范 围。范围指在能够达到一定的准确度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度最大值和最小值。需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80％～120％。

7、精确度。精确度是指在规定条件下，同一均匀样品经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度。精密度一般用相对标准偏差表示，取样检测次数至少6次。 精密度从这三方面考察：重复性、中间精确度、重现性。
a、重复性：是在相同的操作条件下、较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。一般是用100％浓度水平的样品测定6次的结果进行评价。
b、中间精确度：同一实验室，在日期、分析人员、仪器等内部条件改变时，测定结果的精确度。
c、重现性：指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。

8、定 量 限。定量限是指 样品中的被分析物能够被定量检测的最低量，其测定结果需要一定的准确度和精密度，定量 限体现 了分析方法灵敏定量检测的能力。检测需要严格控制含量的杂质，必须考察方法的定量限，以保证杂质能够被准确定量。一般以信噪比为10：1时相应的浓度或进样量来确定定量限。

一般来说，方法验证在分析方法开发的时候就要同步进行，但并非验证所有内容，只要注意验证内容充分，足以证明分析方法的合理性即可。中科检测具有丰富检测经验，可以帮助广大客户进行方法验证，从而保证产品中的高质量生产。如果有这方面的需求，不妨联系我们。

‘叁’ 检验方法验证和确认方案如何制定哪里有参考的模板

首先可以参考国家标准。其次要按照分析化学的原则进行方案设计。比如取样均一、处理过程不要有损失、选择合适的光谱仪器等。浙大哲博检测帮助您！

‘肆’ 检验检测新方法确认的内容包括哪些

方法确认具体来讲包括了标准方法的证实和非标方法的确认两个方面。
我们先来看看方法确认和方法证实的目的是什么：

非标准方法确认目的：
该非标准方法能否合理、合法使用；

标准方法证实目的：
实验室是否有能力按标准方法开展检测、校准活动。

接下来我们看看标准方法证实和非标方法的确认应该如何做：

标准方法证实：
从人、机、料、法、环、测几个方面去证实实验室有能力满足标准方法的要求，有能力开展检测、校准活动。

证实的内容要从七方面去做：
(1) 对执行新标准所需的人力资源的评价，即检测、校准人员是否具备所需的技能及能力；必要时应进行人员培训，经考核后上岗；

(2) 对现有设备适用性的评价，诸如是否具有所需的标准、参考物质，必要时应予补充。

(3) 对设施和环境条件的评价，必要时进行验证。

(4) 对物品制备，包括前处理、存放、辅助试剂等各环节是否满足标准要求的评价。

(5) 对作业指导书、原始记录、报告格式及其内容是否适应标准要求的评价。

(6) 对新旧标准进行比较，尤其是差异分析与比对的评价。

(7) 按标准要求进行完整模拟检测，出具完整结果报告。

标准方法证实应有相关的文件规定及其证实的记录，标准方法变更后应重新证实。

非标准方法确认：

一个非标方法的确认，在文件中要包括以下内容：

a) 方法适当的标识；
b) 方法所适用的范围；
c) 检测或校准样品是什么类型，以及对样品的描述；
d) 被测参数的范围；
e) 方法对仪器、设备的要求，包括仪器设备关键技术性能的要求；
f) 需要用到的的标准物质；
g) 方法对环境条件的要求，对环境稳定周期的要求；
h) 操作步骤，包括：
—样品的标志、处置、运输、存储和准备；
—检测、校准工作开始前需要进行的检查；
—检查设备工作是否正常，需要时，使用前之前对设备进行校准和调整；
—结果的记录方法；
—安全注意事项；
i) 结果接受（或拒绝）的准则、要求；
j) 需记录的分析数据；
k) 不确定度评定。

非标方法的技术确认，需要从五个方面确认：

(1)使用参考标准或标准物质进行比较；
(2)与其他方法所得的结果进行比较；
(3)实验室间比对；
(4)对影响结果的因素作系统性评审；
(5)根据对方法的理论原理和实践经验的科学理解，对所得结果不确定度进行的评定。
技术确认要尽可能全面，并需有确认记录。

‘伍’ 药物分析方法的验证-2020医疗卫生药学知识

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药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适用于相应检测要求，包括原料药及制剂的性状、鉴别、检查、含量测定等有关项目。通常需要验证的检测项目：鉴别、杂质检查(限度试验、定量试验)、定量测定(含量测定、溶出度、释放度等)。方法验证的内容包括专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用性等。

(1)准确度

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。具有一定的准确度是进行定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证方法的准确度，如含量测定、杂质定量试验。

(2)专属性

专属性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确鉴定、检出被测物的特性。通常，鉴别、杂质检查、含量测定均应验证方法的专属性，排除非主药成分的干扰。

(3)线性

线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供试品中被测物的浓度(量)直接呈线性关系的程度，是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量试验和含量测定均需要

(4)范围

范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性，测试方法适用的样品中被测物高低限浓度或量的区间。通常用与分析方法的测试结果相同的单位(如百分浓度)表达。涉及到定量测定的检测项目均需要验证范围，如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。

(5)精密度

精密度系指在规定的测试条件下，同一均质供试品经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度(离散程度)。一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

(6)检测限

检测限系指样品中的被测物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。因此，对杂质限度试验，需验证并证明方法具有足够低的检测限，以保证检出需控制的杂质。

(7)定量限

定量限系指试样中的被测物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。它体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需验证方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测定。

(8)耐用性

耐用性系指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。主要考察方法本身对于可变因素的抗干扰能力。典型的变动因素包括：液相色谱法中流动相的组成、流速和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温等。

练习题：

1.验证杂质限量检查方法需考察的指标有()

A.准确度 B.专属性

C.检测限 D.定量限

答案：ABCD。解析：杂质限量检查方法需考察的指标有准确度、专属性、检测限、定量限。

‘陆’ 三种中介效应检验方法及操作步骤

介绍三种常见中介效应检验方法，分别是因果逐步回归检验法、系数乘积法、改良后的因果逐步回归法，以及如果使用SPSSAU进行操作。

中介效应： 如果自变量X通过影响变量M而对因变量Y产生影响，则称M为中介变量。

例如，上司的归因研究：下属的表现→上司对下属表现的归因→上司对下属表现的反应， 其中的“上司对下属表现的归因”为中介变量。

中介作用的检验模型可以用以下路径图来描述：

方程(1)的系数c 为自变量X对因变量Y的总效应；

方程(2)的系数a为自变量X对中介变量M的效应；

方程(3)的系数b是在控制了自变量X的影响后，中介变量M对因变量Y的效应；

方程(3)的系数c′是在控制了中介变量M 的影响后，自变量X对因变量Y的直接效应；

系数乘积a*b即为中介效应等于间接效应

因果逐步回归法由Baron和Kenny(1986)提出，其检验步骤分为三步：

第一，分析X对Y的回归，检验 回归系数c 的显着性(即检验H0:c=0)；

第二，分析X对M的回归，检验 回归系数a 的显着性(即检验H0:a=0)；

第三，分析加入中介变量M后X对Y的回归，检验 回归系数b和c' 的显着性(即检验H0:b=0、H0:c’=0)。

根据检验结果按下图进行判断：

基于SPSSAU的操作

（1）第一步，登录SPSSAU，上传数据；

（2）第二步，选择【问卷研究】--【中介作用】；

（3）第三步，选择变量拖拽到右侧对应分析框内，点击开始分析。

结果分析

SPSSAU的“中介作用”可直接将中介作用的检验过程自动化，一键提供出上述提及模型结果。

本次结果中共包含三个模型：

①模型1：X对Y的回归模型，结果显示x与y存在显着影响关系，回归系数c=0.130.

②模型2：x对m的回归模型，结果显示x与y存在显着影响关系，回归系数a=0.175.

③模型3：加入中介变量m后x对y的回归模型，结果显示回归系数b、c’均呈现显着性，系数a、b均显着，说明存在中介效应。

第一种因果逐步回归检验法简单易懂、容易理解和解释，因而受到广泛的应用，但有学者认为其检验效能较低，有时候本身有中介作用但却显示没有中介作用。有学者提出乘积系数法的统计功效优于因果逐步回归法，因此，系数乘积法逐渐受到研究者的青睐。

其原理是 检验a*b是否呈现出显着性。 系数乘积法分为两类，一类是基于中介效应的抽样分布为正态分布的 Sobel 检验法 ，另一类是基于中介效应的抽样分布为非正态分布的 Bootstrap抽样法 。

① Sobel中介效应检验法

Sobel检验的前提假设是中介效应^a^b是 正态分布且需要大样本。

使用Sobel系数乘积检验法存在的主要问题是，检验统计量依据的正态分布前提很难满足，特别是样本量较少时。因为即使a，b分别服从正态分布，ab的乘积也可能与正态分布存在较大差异。

当前较为流行的检验方法为Bootstrap抽样法，SPSSAU系统里暂未提供Sobel检验，需要使用Sobel检验可参考此链接进行分析：http://quantpsy.org/sobel/sobel.htm

② Bootstrap抽样法

Bootstrap法能适用于中、小样本和各种中介效应模型，当前SPSSAU【问卷研究】--【中介作用】也使用Bootstrap抽样法进行检验。并且支持一次性放置多个自变量X、中介变量M及控制变量等。

检验方法： Bootstrap抽样法检验是指回归系数a和回归系数b的乘积项（a*b）的95%置信区间是否包括数字0；如果95%置信区间不包括数字0，则说明具有中介作用；如果说95%置信区间包括数字0，即说明没有中介作用。

基于SPSSAU的操作

（1）第一步，登录SPSSAU，上传数据；

（2）第二步，选择【问卷研究】--【中介作用】；

（3）第三步，选择变量拖拽到右侧对应分析框内，点击开始分析。

使用SPSSAU【中介作用】Bootstrap抽样法检验与第一种因果逐步回归检验法在操作上没有任何区别，只是在解读结果时有区分。

结果分析

由上图两项结果指标可知，乘积项结果显着，95%区间并不包括数字0，说明中介变量在x影响y的关系中具有中介效应。

在a*b系数呈现出显着性时，可具体进一步得到中介作用的效应量。

由上图可知，直接效应为0.085，间接效应为0.045，总效应为0.130。间接效应在总效应中占比为34.403%。

因果逐步检验法便于理解和操作而受到欢迎，但也有人研究认为逐步检验会比较不容易得到中介效应显着的结论，检验功效较低。因此，有学者在逐步检验流程上进行相应的修改，得到如下检验步骤：

基于SPSSAU的操作

与上述bootstrap检验法操作方法一致，选择SPSSAU【问卷研究】--【中介作用】，放入对应变量，点击开始分析即可。

结果分析

第一步，检验方程(1)的系数c，如果显着，按中介效应立论，否则按遮掩效应立论。 但无论是否显着，都进行后续检验。

第二步，依次检验方程(2)的系数a和方程(3)的系数b，如果两个都显着，则间接效应显着，转到第四步；如果至少有一个不显着，进行第三步。

第三步，用Bootstrap法检验。如果显着，则间接效应显着，进行第四步；否则间接效应不显着，停止分析。

如果第二步中，系数a、b有一个不显着，则查看a*b中介效应是否显着（a*b95%BootCI是否包括数字0）

第三步：间接效应显着

第四步，检验方程(3)的系数c′，如果不显着，即直接效应不显着，说明只有中介效应。如果显着，即直接效应显着，进行第五步。

第五步，比较ab和c′的符号，如果同号，属于部分中介效应，报告中介效应占总效应的比例ab/c。如果异号，属于遮掩效应，报告间接效应与直接效应的比例的绝对值|ab/c|。

本次研究，自变量x对因变量y的总效应是0.130，影响显着；其中直接效应为0.085，间接效应0.045，具有显着性；最终以有部分中介作用作为结论，中介效应在总效应占比为34.403%。

（1） 中介作用前需要标准化处理吗？

一般情况下，在进行中介作用前需要标准化或中心化处理，可使用数据处理->生成变量功能批量完成标准化或中心化处理；SPSSAU提供的中介作用检验默认不会对数据进行处理。

（2）SPSSAU分析结果中有对检验结果的自动化判断，用户可以直接使用。智能分析中也有相应解读，如果有不了解的地方，可以点击右侧的“灯泡”按钮查看帮助手册。

（3）spssau也支持链式中介检验，操作方法是点击【问卷研究】--【中介效应】，[中介类型]选择“链式中介”。提供中介效应分析方法为非参数百分位Bootstrap法。

（4）如果数据是显变量如何处理？

如果数据是显变量，此时可转换成潜变量再处理即可。使用【生成变量】--【平均值】功能。当然如果是使用结构方程模型进行研究分析中介作用时，建议使用因果逐步回归检验法进行中介效应验证。SPSSAU提供的结构方程模型暂不提供Bootstrap抽样法检验。

‘柒’ 新版GMP要求对检验方法进行验证或确认，具体如何做

具体可依据中国药典2010版附录--<分析方法验证>指导原则 来做.
具体项目有专属性,耐受性,灵敏度,重复性/精密度,准确度,线形等.
检验方法验证中,每项检查所需样品量根据检验项目性质不同而不一样,不一定是三批. 但一般像定量检查项目, 每个项目需要的样品数据最少为三批.