分子间连接方法图解

① 分子克隆中常用的连接方法及原理

方法：DNA片段的制备、载体的选择、片段与载体连接。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。

原理：外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。

但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

载体DNA的选择

质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

以上内容参考：网络-分子克隆

② 分子是怎么连接的

分子的连接是因为分子间存在吸引力与斥力，当吸引力大于斥力时分子就会连接到一起。

③ 分子与分子连接方式

范德华力、氢键、盐键、疏水作用力、芳环堆积作用、卤键等之类的分子间作用力.

④ DNA连接酶的连接手段

目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：
第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；
第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；
第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。
粘性末端DNA片段的连接
DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。
平末端DNA片段的连接
常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。
同聚物加尾法
这种方法的核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称之为poly（dA）尾巴（图2-7）。反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly（dT）尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法（homopolymertail-joining），简称同聚物加尾法。
衔接物连接法
所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。
DNA接头连接法
DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。

⑤ 水分子间的联接与排布

水分子之间是靠氢键使其联接和排布起来的。所谓的氢键，是指水分子中的氢原子，在保持同本水分子中的氧原子最基本的共价键的同时，又能同相邻水分子中的氧原子产生一种静电吸引。这种吸引力（即氢键的强度）比普通分子间力（范德华力）要强一些，但比典型的离子键要弱一些。氢键具有饱和性和方向性，饱和性是指每个水分子最多只具有两个氢键；方向性是说氢键按一定方向产生于氧原子的两个“孤对”电子处。这样一来，水分子就具有两种类型的键，即存在于水分子内部氢、氧原子间的极性共价键和存在于相邻分子间的氢键。

氢原子在通常情况下是一价的，但在有氢键联接的情况下又似乎是二价的。形成氢键是氢原子的一种特性，这可能与氢原子的体积小及所处的静电场强度大小有关。生成氢键的相邻两个水分子，共同占有一个氢原子核（质子），但双方占有的程度不是对等的，氢键的键强度为21.353 kJ/mol，共价键的键强度为498.229 kJ/mol。相比较而言，范德华力的键强度仅为21.353 kJ/mol。

氢键是联接相邻水分子内两个氧原子的桥梁，使水分子间较牢固地联接起来。尤其是当水处于液态时，氢键表现出高度的韧性，键长往往不固定，可发生摆动，但却不易断开，以此来阻止水分子向蒸汽飞脱。

相邻水分子间由于有氢键的联接，使水能以（H₂O）_n巨型分子存在。这里，n一般在12～860之间变化，主要由温度所决定。水以巨型分子（分子群）存在是液态及固态水的基本形态。这种由单个水分子结合成比较复杂的多分子而不引起水的化学性质变化的现象，称为水分子的缔合作用。水分子的缔合作用一般可用下列平衡式表达：

水文地球化学

式中Q表示热量。由于缔合作用是放热反应，因此当温度升高时，平衡（1-1-2）向左移动，缔合程度减少，在沸点时只有少数缔合分子。而当温度降低时，水的缔合作用加强，在4℃，缔合程度最大，此时水的密度最大，体积最小。事实上，自然界中的水只有以气态存在时才呈单分子水，而以液、固态存在时均以巨型分子形式存在。

目前对水分子结构与排布的研究，多是以对冰结构的研究为基础的。根据X射线及电子衍射法对冰体的研究，在冰的晶格中，每一个水分子均与其周围的四个水分子相联接，构成了比较规则的四面体形态（图1-1-5）。在每个四面体中，位居中心的水分子均被四个相邻的水分子所环绕，形成四个氢键并构成冰晶体的中空结构，从而使冰的密度减小。由许多这样的四面体相互联接起来，便形成了网层状的庞大冰体。

图1-1-5 相邻冰分子间的四面体构形

当温度升高时，冰开始融化解体，冰的四面体结构逐渐遭到破坏，但由韧性键来继续维持原来的四面体结构。随着温度的继续升高，四面体联接才一个个地断开。研究表明，当温度为20℃时，水的氢键从整体上已经解体了53.8%，但这时以各种缔合体形式存在的水分子群仍占70.6%。据统计，其中拥有四个氢键的水分子约占23.3%，拥有3个氢键的水分子约占20.2%，拥有2个氢键的水分子约占4.1%，拥有一个氢键的水分子约占23%，各类缔合体的平均水分子数n为57。

⑥ 高分子链的连接方式

高分子链的连接方式一般是通过碳与碳之间的单键或双键来连接，还有一些是通过碳与氧或者氮之间的化学键来连接。

⑦ DNA的片段之间有哪些连接

（1）具互补黏性末端片段之间的连接：连接反应可用emphasis：role=italicE.coliemphasis：DNA连接酶，也可用T4：DNA连接酶。待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果是用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补黏性末端，可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子往往消失了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。

（2）具平末端DNA片段之间的连接：连接反应必须用T4：DNA连接酶。只要两个DNA片段的末端是平末端的，不管是用什么限制性内切核酸酶酶切后产生的，还是用其他方法产生的，都同样可以进行连接。如果用两种不同限制性内切核酸酶酶切后产生的平末端DNA片段之间进行连接，连接后的DNA分子失去了那两种限制性内切核酸酶的识别序列。如果两个DNA片段的末端是用同一种限制性内切核酸酶酶切后产生的，连接后的DNA分子仍保留那种酶的识别序列，有的还出现另一种新的限制性内切核酸酶识别序列。

（3）DNA片段末端修饰后进行连接：待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后，产生的末端未必是互补黏性末端，或者未必都是平末端，因此无法进行连接。在这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是采用核酸外切酶Ⅶ（exonuclease：Ⅶ，Exo：Ⅶ）将黏性末端修饰成平末端；采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补黏性末端。有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA，或自行连接成二聚体或多聚体，可采用碱性膦酸酯酶将其中一种DNA片段5′-P修饰成-OH。

（4）DNA片段加连杆后连接：如果要连接既不具互补黏性末端又不具平末端的两种DNA片段，除了上述用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外，还可以采用人工合成的连杆（linker）或衔接头（adaptor）。先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA片段的末端，然后用合适的限制性内切核酸酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补黏性末端，最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。此外，也可以根据两DNA片段的末端，选用合适的衔接头直接把两DNA片段连接在一起。

⑧ 分子和分子之间是怎么连接的

分子之间没有键，主要是通过分子间作用力（即范德华力）进行连接。 只要是分子构成的物质都满足。常接触的就是气体。分子结构，或称分子平面结构、分子形状、分子几何，建立在光谱学数据之上，用以描述分子中原子的三维排列方式。分子结构在很大程度上影响了化学物质的反应性、极性、相态、颜色、磁性和生物活性。

什么是范德华力

范德华力是指分子间作用力，又称范德瓦尔斯力。是存在于中性分子或原子之间的一种弱碱性的电性吸引力。分子间作用力（范德瓦尔斯力）有三个来源：

1、极性分子的永久偶极矩之间的相互作用。

2、一个极性分子使另一个分子极化，产生诱导偶极矩并相互吸引。

3、分子中电子的运动产生瞬时偶极矩，它使临近分子瞬时极化，后者又反过来增强原来分子的瞬时偶极矩。

这种相互耦合产生净的吸引作用，这三种力的贡献不同，通常第三种作用的贡献最大。