禽类疾病快速高灵敏检测方法

Ⅰ 食源性致病菌的快速检测方法有哪些

检测致病菌大概有如下几种方法。
1 传统生物学方法，按照标准检测，最麻烦，最传统，但是最经典，可作为其他方法之验证。
2 显色培养基方法，用国外进口显色培养基检测，比较方便，目前最流行，使用简单，也不贵。
3 胶体金试纸条检测，购买国外进口试纸条，现场检测，这种方法10分钟可以检测到结果。但是检测灵敏度偏低。
4 ELISA，酶联免疫实验。目前只有国外进口，欧美四家大公司垄断了全球95%以上的市场，一个96孔试剂盒，售价高达5000-6000元，非常无奈，但是是国外最流行的快速筛选技术，检测灵敏度、检测周期都比较理想，不过国内现在有公司专业在做这方面的试剂盒了，估计价格很快会降下来，可能是将来主流的检测技术了，部分已经写进国标了。
5 IC-PCR，免疫捕捉PCR，用抗体特异性识别捕捉，之后再PCR扩增。最大的优势是，病原经过抗体识别、PCR检测双重检测，可一次鉴定到种，检测灵敏度可以达到十的两次方，不用核酸提取，所有反应在一个PCR管里进行，减少了病原的损失，缺点是检测时间大致在4个小时，是一张理想的验证手段。
6 Direct-PCR，增菌后直接PCR，比较简单的验证手段，增菌后直接扩增，受PCR检测体系的现实，灵敏度偏低，但是取决于样品中的菌含量。
7 Nested-PCR，两对引物巢式PCR。两对引物两次扩增，最大的优势是检测准确性、灵敏度可绝对保障，劣势是检测时间较长。
8膜过滤PCR，利用病原富集装置，富集之后检测，最笨的一种方法，但是是最实用的，病原经过微孔滤膜过滤后，可高效富集病原 ，之后去检测，大大提高检测灵敏度。
9 BIO-PCR，培养增菌后PCR扩增，这个技术只能做研究用了，就是分离培养后，用PCR检测，乏善可陈。
10 IMS-PCR，免疫磁珠PCR，用免疫磁珠捕捉，之后进行PCR，用磁珠富集样品中的病原，之后直接PCR扩增，非常实用的方法，主要是可以富集病原。
11 BAX快速检测系统，按照系统说明书操作。贵族实验室用的东西，灵敏度和其成本、假阳性一样出色。
12 RiboPrinter快速检测系统，按照系统说明书操作。同上，大同小异。

Ⅱ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

Ⅲ 如何鉴别禽类的大肠杆菌病与沙门氏菌病

大肠杆菌是人和动物肠道等处的常在菌，禽大肠杆菌在鸡场普遍存在，特别是通风不良，大量积粪鸡舍，在垫料、空气尘埃、污染用具和道路、粪场及孵化厅等处环境中染菌最高。

本病主要发生在密集化养禽场，各种禽类不分品种性别、日龄均对本菌易感。特别幼龄禽类发病最多，如污秽、拥挤、潮湿通风不良的环境，过冷过热或温差很大的气候，有毒有害气体（氨气或硫化氢等）长期存在，饲养管理失调，营养不良（特别是维生素的缺乏）以及病原微生物（如支原体及病毒）感染所造成的应激等均可促进本病的发生。

临床症状与病理变化

本病常引起幼雏或成鸡急性死亡。特征性病变是肝脏呈绿色和胸肌充血，肝脏边缘纯圆，外有纤维素性白色包膜。也可能发生下列病变

1.心包炎:心外膜水肿，心包囊内充满淡黄色纤维素性渗出物，心包粘连。

2.大肠杆菌性肉芽肿:病禽消瘦贫血、减食、拉稀，在肝、肠（十二指肠及盲肠）、肠系膜或心上有菜花状增生物，针头大至核桃大小，很容易与禽结核或肿瘤相混。

3.坠卵性腹膜炎及输卵管炎:输卵管扩张，内有干酪样团块及恶臭的渗出物。肠卡他性炎等病变。

4.
关节炎及滑膜炎:表现关节肿大，内含有纤维素或浑浊的关节液。

5.脑炎:表现昏睡、斜颈，歪头转圈，共济失调，抽搐，伸脖，张口呼吸，采食减少，拉稀，生长受阻，产卵显着下降。主要病变脑膜充血、出血、脑脊髓液增加。

6.肿头综合征:表现眼周围、头部、颌下、肉垂及颈部上2/3水肿，病鸡喷嚏，并发出咯咯声，剖检可见头部、眼部、下颌及颈部皮下黄色胶样渗出。

实验室检验：采用病原学检验方法，排除其他病原感染（病毒、细菌、支原体等），经鉴定为致病性血清型大肠杆菌，方可认为是原发性大肠杆菌病。

禽沙门氏菌病，由一种或多种血清型沙门氏菌所引起的一大群急性或慢性禽类疾病的统称。危害性大。主要包括3种：

1.鸡白痢

由鸡白痢沙门氏菌引起,最常见于鸡和火鸡。主要侵害雏鸡，呈急性败血症，大批死亡。幸存者多转成慢性或带菌者。对病程稍长者剖检可见心、肺出现坏死或结节，肝出血与坏死，胆囊肿大。母鸡感染后产蛋量、受精率与化率下降。剖检可见卵子变形、变色和变硬。公鸡则呈睾丸炎。

2.鸡伤寒

为鸡沙门氏菌所致的鸡与火鸡的败血症，其他禽类罕见。可经蛋传播。除雏鸡外亦常使青年或成年鸡群发生败血症而招致10～50％的死亡率。急性者无明显病变。亚急性或慢性者常见血液稀薄，肝肿呈青铜色，其表面与心肌有灰白色粟粒状坏死灶。偶有心包炎和卵黄性腹膜炎。卵子出血、变形、变色。雏鸡表现似鸡白痢。

3.禽副伤寒

由鼠伤寒等多种能运动的沙门氏菌引起的禽类疾病。可由污染的饲料感染，呈地方流行性。幼禽多呈急性和亚急性，成年或未成年禽则多为慢性或隐性感染。幼雏常因急性败血症而迅速死亡。成年患禽长期带菌与排菌。慢性的体瘦，肠道呈坏死性溃疡。雏鸡常出现颤抖、喘息和眼睑。病程稍长者可见卵黄凝固，肝、脾充血且有条纹状或针尖状出血与坏死灶。

实验室检验：根据流行特点、临床特征和病理变化只能怀疑为本病或作出初步诊断，确诊需采用病原学检查和血清学试验。

Ⅳ 如何实现快速检测及有效控制沙门氏菌

沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性肠杆菌, 也是肠杆菌科中最主要的食源性致病菌。据有关资料统计由沙门氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所占比例已超过三分之二，2007年发生的“ 花生酱事件”以及 2008 年发生的“ 西红柿 事件”等[1]沙门氏菌中毒事件的发生也使得食品中沙门氏菌的检测受到人们的普遍关注。本文主要是对食品中沙门氏菌的传统检测方法以及后续建立的以分子生物学、免疫学、生物传感器和电化学为基础的快速检测方法进行了系统的综述，旨在为该致病菌的检测方法的研究应用提供一定的参考。
1、 传统的检测方法（国标法）
目前, 我国对食品中沙门氏菌的检测大多采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对食品样品进行检测，这种传统的培养方法可分为前增菌、增菌、分离培养、生化试验和血清学鉴定等步骤进行。虽然传统培养法可靠性高，但是其操作繁琐且耗时费力，并不能满足食品快速检测的要求。
2、分子生物学检测方法
2.1聚合酶链反应技术
PCR技术是一项敏感性高、特异性强且快速准确的微生物检测技术，也被许多学者用于对食品中沙门氏菌进行检测和研究。汪琦等[2]就采用传统培养方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 种方法对沙门氏菌进行检测。在常规PCR的基础上宋东晓[3]建立了检测食品中沙门氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技术也运用于食品中沙门氏菌的检测，钟伟军[4]通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法，此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。
2.2核酸探针技术
核酸探针技术是根据核苷酸碱基互补的原理,在已变异的DNA样品中加入用同位素等标记的DNA特异片段，在一定条件下两片段进行杂交从而达到检测DNA的目的。此技术不仅简便、快速而且敏感性高、特异性强，已用于食品中沙门氏菌的检测。Almeida等[5]通过建立一种新颖的肽核酸探针结合荧光原位杂交方法对血液、粪便、水以及婴儿奶粉样品中沙门氏菌进行了检测，准确度高达 100%。
2.3基因芯片技术
基因芯片技术是利用已知核酸序列的探针与靶核苷酸序列杂交，然后通过信号检测对其进行定性与定量分析，在沙门氏菌等各种致病菌的分析检测中有很好的应用前景。饶宝等[6]通过建立检测致病菌的基因芯片检测方法，设计了通用引物和特异性探针: 沙门氏菌探针、大肠杆菌探针和金黄色葡萄球菌探针,实现了同时检测并区分沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的目的。祝儒刚等[7]运用多重 PCR 结合基因芯片技术建立了检测肉及肉制品中的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌等5种食源性致病菌的快速检验方法。
2.4噬菌体裂解技术
噬菌体有特异性裂解细菌的作用。张碧波等学者利用此技术进行沙门氏菌
快速检测，结果和其他学者相同，据此得出特异性噬菌体可以检测出沙门氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌体裂解对150份食品样品进行快速检测，结果说明肠杆菌科噬菌体组合对培养10h的沙门氏菌敏感性和特异性较高，这对实现沙门氏菌实时、快速而准确的检测有重要意义。
2.5环介导等温扩增技术（LAMP）
环介导等温扩增技术是2000年Notomi等开发的一种新的恒温核酸扩增方法,此方法的特点是特异性强、灵敏度高且简单、快速,适合对大规模样品的快速检测[9]。李佳桐[10]通过实验建立了沙门氏菌的LAMP检测方法,并将此方法与常规PCR进行比较,结果显示：LAMP方法对沙门氏菌的检测恒温65℃下只需要40min,只扩增沙门氏菌,不会扩增其他革兰氏阴性菌,最低可检出浓度10cfu/mL,比常规PCR的最低检出浓度高1个数量级,通过添加荧光染料SYBR Green Ⅰ,能够快速简便的观察检测出绿色的阳性结果十分明显的区别于橙色的阴性结果。
3、免疫学方法
3.1酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附法简称 ELISA， ,此技术敏感性高 ,不需特殊设备 ,结果观察简便，早在1977年就有报道将酶联免疫吸附法用于食品中沙门氏菌的检测。伍燕华等[11]设计捕获抗体和检测抗体，建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法对食品中的沙门氏菌进行检测。张帅等[12]建立双抗夹心ELISA体系，检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800CFU/g，等均并与其他血清型沙门氏菌、单增李斯特菌等菌均无交叉反应,特异性良好。
3.2免疫荧光标记技术
免疫荧光标记技术是根据抗原抗体的特异性反应，将荧光素标记在已知抗原(或抗体)上,与特异抗体(或抗原)结合后产生荧光，可用来定位抗原或抗体、并通过定量分析，确定测定含量。叶明强[13]基于纳米免疫磁珠富集,免疫量子点标记,建立了一种食品中沙门氏菌的含量进行快速检测的方法，研究出了一种新型的免疫荧光食源性致病菌检测技术。
3.3斑点免疫金渗滤法
免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物结合免疫原理的一种应用于抗原抗体的新型技术，该技术运用最广泛的就是斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技术对沙门氏菌的快速检测进行了研究，曹春梅等[14]是利用斑点免疫金渗滤法对沙门氏菌O9抗原进行了研究，结果表明此法简单、快速，适合推广运用；孔繁德等[15]是通过建立直接检测沙门氏菌的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒对该菌进行了研究。
3.4免疫磁性分离技术
免疫磁珠分离技术是将特定病原体的单抗或多抗与磁珠微球偶联，并通过抗原抗体反应形成磁珠，在外加磁场作用下磁珠会发生定向移动，从而达到分离目标病原体的作用。食品样品中致病菌含量很少，常规的方法是很难从中分离出来的，借助免疫磁性分离技术可以达到快速分离的目的。王海明等[16]应用磁免疫技术建立快速检测食源性沙门氏菌的方法，结果表明此方法能对食品基质中的目标菌进行快速有效的富集,其检测限<10cfu/25g,检测周期约为40小时。胡霏[17]也通过实验针对鼠伤寒沙门氏菌建立免疫磁分离技术结合荧光层析技术的快速检测方法。
4、生物传感器技术
生物传感器是利用一些生物活性物质如酶 、多酶体系 、抗体等做为敏感器件，然后配以适当的信号传导器所构成的分析检测的工具。我国学者已采用此法对沙门氏菌的抗原、抗体的免疫吸附进行检测，并已用于快速检测食品中致病的沙门氏菌，而仅需 1h 完成，达到了快速的检测目的。宁毅[18]在对碳纳米管性质研究的基础上,结合分子探针构建了碳纳米管生物传感器，并将其用于沙门氏菌的检测，结果显示所构建的传感器灵敏度高、特异性强、稳定性好。
5、电阻抗技术
电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，因为具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点，目前此法已用于食品中沙门氏菌检测检验并已通过美国公职分析化学协会(AOAC)认可。陈广全等[19]建立了电阻抗法快速检测食品中沙门氏菌的方法，并将其与常规培养法进行比较，对食品中的沙门氏菌属进行检测,结果表明电阻抗法比传统培养法更加快速、可靠。
6、总结
综上所述，沙门氏菌检验技术正从传统的培养方法向分子检测方法改进，并向仪器化、标准化、自动化方向发展，并且食品安全、致病菌等问题对人类健康以及生活环境都造成了严重威胁，加强沙门氏菌检测势在必行。目前沙门氏菌快速检测技术大多具有检测迅速、灵敏度高、特异性强等特点，此外这些方法还具有各自的优点和局限性，在未来发展过程中需要我们不断改进和创新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙门氏菌快速检测技术。

Ⅳ 瘦肉精检测方法有哪几种

目前的瘦肉精检测方法，大致有一下四种方法，市场上的一些检测物品也是根据这些方法衍生而来的。

气象色谱-质谱法，简称GC-MS，GC-MS法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。

高效液相色谱法，此法适合测定热不稳定和强极性的β-激动剂及其代谢产物，而且，HPLC可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱（MS）等系统联用，容易实现分析过程的自动化。其优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳性率低；缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制。

酶联免疫吸附法，利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，通过化学方法将植物辣根过氧化物酶（HRP）与克伦特罗（CL）结合，形成酶偶联克伦特罗。将固相载体上已包被的抗体（羊抗兔IgG抗体）与特异性的抗克伦特罗抗体结合，然后加入待测克伦特罗和酶偶联克伦特罗，它们竞争性与克伦特罗抗体结合，洗涤后加底物，根据有色物的变化计量待测克伦特罗量。

胶体金免疫层析法，利用竞争法胶体金免疫层析技术，检测液中的Clen与金标垫上的金标抗体结合形成复合物，若Clen在检测液中浓度低于灵敏度值，未结合的金标抗体流到T区时，被固定在膜上的Clen-BSA偶联物结合，逐渐凝集成一条可见的T线；若Clen浓度高于灵敏度值，金标抗体全部形成复合物，不会再与T线处Clen-BSA偶联物结合形成可见T线。

Ⅵ 某种食物中含黄曲霉素，用最简单的方法怎么检测

薄层分析法(TLC)、液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、毛细管电泳法(CE)、荧光光度法(IA C/S FB)。

1、薄层分析法(TLC)

TLC法是检测黄曲霉素最为经典的方法，也是以前最为常用的方法，至今仍为一些检测机构所用，也是一种国标方法。其原理是针对不同的试样，用适宜的萃取溶剂将黄曲霉素从试样中萃取出来，经柱层析净化后，再在薄板上展开后分离。

5、荧光光度法(IA C/S FB)

IA C/SFB法也是一种常用的国标方法。该方法的原理是利用各种黄曲霉素的荧光特性差异用荧光光度计测定试样中黄曲霉素的含量。

该方法对检测人员身体健康无危害，检测速度迅速，灵敏度高，适用于大量试样检测，且定量准确，但检测费用较高，需要配置专用设备，且不能对单一的毒素进行检测。

(6)禽类疾病快速高灵敏检测方法扩展阅读：

黄曲霉毒素的毒性有三种临床特征：急性中毒、慢性中毒和致癌性，有致癌、致畸、致突变的作用。

其致癌特点是：致癌范围广，能诱发鱼类、禽类，各种实验动物、家畜及灵长类等多种动物的癌症，除主要诱发肝癌外，还可诱发胃癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌，卵巢及小肠等部位的肿瘤，亦可导致出现畸胎。因此许多国家都制定了有关食品中黄曲霉毒素限量标准。

Ⅶ 怎么对禽类做h7n9检测

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Ⅷ 血清学诊断 分子生物学诊断 什么叫

常规血清学诊断技术
1.1血清凝集抑制试验(HI)
因为许多动物病毒能够凝集某种类动物的红细胞,由于血凝反应可被特异性抗体所抑制,抗体与病毒结合后,血凝素即不能吸附于红细胞表面的受体上。HI不象其它血清学试验,不需要种属特异的结合〔1,2〕,因此特异性不好。一般检测快速,用于大量筛选野生或饲养的动物样品中的抗体。
1.2 补体结合试验(CF)
由于一个抗体分子与抗原结合后,可以导致数百个补体分子的激活,呈现一定的放大作用,所以补体结合试验是一个比较敏感的方法。虽然在某些病毒型的鉴定上,补体结合试验的检测能力有时不及中和试验和血凝抑制试验,但补体结合试验稳定,特异性高,重复性好,一直仍用于动物血清学中特异性抗体的定量检测〔3〕。
1.3 免疫荧光抗体技术
通过显微镜标本的免疫荧光染色而显示其结果,由于病毒抗原的标记比较困难,常用标记抗体检查未知抗原,此技术具有抗原抗体反应的特异性和染色技术的快速性,并可以在细胞水平上进行抗原定位,故在病毒学研究和诊断中都是一种应用很广的方法〔4~7〕。另外,用此方法也可检测海洋微生物,尤其是细菌〔8〕,避免了细菌培养,从而提供了特异、快速的检测方法。
1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA是应用最广的一项免疫学诊断技术,以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固相载体上,随后的一系列免疫学和生物化学反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定试验,无论是病毒病、禽传染性支气管炎抗体检测〔9〕、禽多瘤病毒特异性抗体检测〔10〕,还是细菌,例如牛布鲁氏杆菌病〔11,12〕,或是寄生虫引起的疾病、犬弓形体病〔13〕、羊肝片吸虫〔14〕,都应用到了酶联免疫吸附试验技术。因此,ELISA在各种动物疾病诊断上发挥了重要的作用。ELISA作为根除控制计划的初筛方法是非常理想的,费用相对较少,比常用的血清学方法有明显的优点,不需要抗体的第二特征,例如血凝性、结合补体的能力〔11〕,用时少,敏感性、重复性、特异性好,可筛选检测大量的样品〔15〕。利用纯化的抗原,单克隆抗体可提高反应检测的特异性〔9,10,11〕。
1.5 斑点酶联免疫吸附试验
将酶标反应板换成硝酸纤维膜,即为斑点酶联免疫吸附试验,将少量的试剂点在硝酸纤维膜或其它能结合蛋白的膜上,同抗原特异的抗体以及酶结合抗体反应,加入能形成不溶性有色沉淀的底物,使固相膜染色,形成有颜色的斑点,直接判读结果。利什曼原虫病〔16〕,牛呼吸道合包体病毒〔17〕,无钩绦虫〔18〕,免疫寄生虫〔19〕,克服了显微镜检查的麻烦。因硝酸纤维素膜吸附性能强,一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜条,并在同一张膜条上点有多种抗原,将整个膜条与同一份血清反应,则可同时获得对多种疾病的诊断结果,3种主要禽类疾病的同时检测〔20〕,多种蛋白的分析〔21〕,此方法快速,容易操作,已广泛应用于动物疾病的诊断。
免疫血清学技术的发展趋向一直是高度特异性、高度敏感性,精密的分辨能力,高水平的定位,试验电脑化,反应微量化,方法标准化和试剂商品化,以及方法简便、快速。随着生物化学和分子生物学等学科迅速发展,相继出现了许多新的诊断技术,可以从分子水平对疾病的致病机理,诊断、治疗和预防进行研究。
2与分子生物学技术相结合的诊断技术
2.1PCR-ELISA
将PCR技术与ELISA相结合的一种抗原检测技术,又称免疫PCR。该技术是由Sano T等在1992年建立的,其本质是一种以PCR技术代替酶反应来放大显示抗原抗体结合率的改进ELISA,利用ELISA技术检测PCR扩增的产物〔3〕。利用了PCR的指数扩增效率带来极高的敏感度,同时又具有高的特异性的抗原检测系统。用亲和素包被微孔板,封闭后,加入标记于捕获探针3’端的生物素,而捕获探针5’端和待检靶序列5’端的一段互补,通过生物素和亲和素的交联作用,将捕获探针固定在微孔板上,制成固相捕获系统。其次PCR缓冲液中加入一定比例的地高辛标记的DUTP,经PCR扩增后,扩增产物与微孔板上的捕获探针进行液相杂交,带有地高辛的靶序列即被捕获,再在微孔板中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体,再加入底物如TMB显色,进行ELISA检测。
此法具有高灵敏度,检测结果可靠,可以进行半定量检测的优点,可用于病毒的检测、疾病诊断和目的基因检测。此方法较常规PCR灵敏度提高了10倍〔22,23〕,此方法鉴定PCR产物更快速,判定结果客观,易于操作,尤其在筛选大量品时,是非常理想、有用的工具。PCR-ELISA方法避免了在常规PCR中,由于非特异的产物和不名原因引起的条带反应,而作出的主观解释〔23〕。可筛选大量食源性病原体,帮助加工厂监测食品的污染水平,进行危险品分析〔24〕。尤其在寄生虫检测方面,以前多用血涂片,而现在应用PCR-ELISA检测牛巴

Ⅸ 血清中禽流感抗体含量的检测方法

禽流感是由A型流感病毒引起的一种高度接触性传染性疾病。给世界养禽业造成了巨大的经济损失。禽流感病毒可分为不同的亚型，世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7两种亚型引起，而人对其中的H1和H3亚型易感。快速诊断禽流感病毒具有重大意义。目前禽流感的实验室检测是比较快速、准确的方法。随着血清学实验技术和生物工程技术的飞速发展，禽流感诊断技术的研究也不断取得新进展。琼脂扩散试验、血凝和血凝抑制试验等常规方法的使用虽有一定的优势，但免疫荧光法和ELASA也日益显示出其快捷准确的特点：分子生物学的发展为核酸序列分析法的建立创造了条件,也使PCR，RT－PCR及核酸探针等检测技术成为可能。这篇文章就是对有关该病的诊断方法加以总结，并提出了认为比较可行的改进方法，旨在方便对禽流感做出及时而有效的诊断并采取相应措施。

1. 病毒的分离鉴定

无菌采集病料经处理后接种9－11日龄鸡胚，收取尿囊液测定血凝活性。若为阴性则应继续盲传2－3代。对具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫(ND)抗血清做血凝抑制(HI)试验!以排除ND感染。然后用免疫扩散等方法来检测特异核心抗原，核糖蛋白(NP)或基质蛋白(MP)，再用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。分离鉴定的同时进行致病力试验，确定毒力强弱。但是流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，故近来在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。然而，该两种细胞无细胞核，沉积慢，一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果，同时在“U”型孔板中，很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空[1]。

病毒的分离鉴定对禽流感的诊断比较确实,但操作程序繁琐、费用多、耗时费力。

2. 血清学诊断技术

2.1 琼脂扩散(AGP)试验

进行病毒抗原型特异性鉴定即用已知阳性血清和末知抗原进行AGP试验。

受检样品是具有血凝素活性的鸡胚尿囊液。AGP是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，即抗核糖蛋白(RNP)和基质蛋白(MP)抗体，因而适用于鉴定流感病毒 。1979年Beard首次将AGP用于禽流感抗体检测[2]。

此法虽简单易行，但是敏感性较差，易出现假阳性。AGP最常用的是免疫双扩散，赵增连、陈海燕等分别开展了禽流感病毒快速定型双扩散法的研究，不仅提高了其敏感度，且快速省时，在此方法基础上建立的AGP诊断技术及其诊断试剂盒，在全国范围内得到推广应用，并取得良好的效果。

2.2 血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)

一般情况下，新分离毒株要先鉴定出特异性NP或.MP抗原型(用AGP)确定禽流感病毒，再做HA亚型的鉴定[3]。

现已有人采用改进HA试验方法，称为HA加敏法。该法测抗体效价比常规性高2－4倍，若抗原用乙醚裂解其敏感性比常规法高4－6倍，但观察时以30min内为好，否则易出现假阳性。另外，还应注意在HI试验时，应先除去特异性凝集反应。许多禽类血清都含有非特异性因子，能和红细胞表面受体竞争性地作用于病毒表面的血凝素而发生非特异性凝集反应。通常用受体破坏酶(RED)即霍乱菌培养液处理法或高碘酸钠法制备血清[4]。

HA、HI 特异性好，是亚型鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，并且由于用已知HA亚型的抗血清不能检出新的HA亚型的禽流感病毒，所以用该方法鉴定不如琼脂扩散实验简便和快捷。

2.3 神经氨酸酶抑制试验(NIT)

根据A 型流感病毒的表面抗原特性,特别是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)特性，不仅可通过HI试验对病毒进行坚定，而且可通过NI试验进行鉴定。1983 R.A.Van.Densen介绍了NI试验的一种改进法－平板微量NI试验，此法虽不能提供常量法的定量，但却是A型流感病毒的病毒分类和抗体检测的快捷方法， 试验证明微量NI试验能对分离物做出准确鉴定而常量NI试验检测亚型混合物似更敏感[5]。

目前国家兽医实验所已将微量NI试验列为流感病毒分离物定型及筛选畜禽血清9型NA抗体的常规方法，诊断中也已广泛采用此法特别是美国在80年代火鸡发生流感病毒期间，每次流行所得的血清样本用微量NI试验所作出的A型流感病毒亚型鉴定结果已为病毒分离、疫苗接种和流行病学资料所证实。这种方法已被证明是快速的且成本较低和有可重复性。这种技术的可靠性将导致NI试验的广泛应用。

2.4 中和试验(NT)

病毒中和实验技术是反映机体抵抗特定病毒感染能力的最可靠方法。流感病毒中和实验技术有以下优点：（1）由于中和抗体作用于流感病毒表面血凝素蛋白（HA），使流感病毒失去感染能力，因此，流感病毒中和实验主要用于检测血清中的特异性抗血凝素蛋白抗体。（2）流感病毒中和实验既能检测病毒株的功能性变化，又能反映机体的抗病毒水平。（3）该方法主要使用感染性病毒，不需要进行病毒或病毒蛋白的纯化，因此，可以被迅速用于检测新病毒或人群免疫状态[6]。

以中和试验(NT)来鉴定或滴定流感病毒时常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒(如NDV)的中和试验相同。病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。

NT试验是最敏感而特异的血清学方法，只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应，特别是与吸咐到宿主细胞上的病毒表面抗原相对应，才能在实验中取得满意的显示效果。 因此，某一个血清型的中和试验抗体只与同组内地其他病原表现出有限的交叉反应。病毒中和试验操作繁琐耗时费料，临床上几乎不用。但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方都要与之为标准进行比较[7]。

2.5免疫荧光技术(IFT)

免疫荧光技术就是荧光抗体技术(FAT)。 IFT早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。1984年滨西法尼亚州爆发禽流感时，Skeeles将IFT首次用于AIV的检测。IFT最早用于病毒的鉴定和定位病毒感染细胞中特异性抗原。主要是核内荧光:用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光[8]。

用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法即在组织触片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光 。一种AIV的荧光抗体可用来检测不同亚型的其他病毒。

IFT用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点，而且费用较低，其敏感度同病毒的分离鉴定相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避免和降低标本中出现的假阳性(非特异性荧光)问题。

对一株杂交瘤细胞分泌的流感病毒的单克隆抗体进行检测时，发现间接固相免疫荧光技术的敏感性比HI 高40－150倍。间接免疫荧光技术也可以用来检测核蛋白(NP)基质蛋的(MP)抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解[9]。

2.6 酶联免疫吸附法(ELISA)

ELISA的基本原理是：酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合，再遇酶底物时，在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应，即形成有色的产物，便可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。该方法具有特异性、敏感性、快速性和简易性等优点。在流感病毒微量中和实验中，酶结合物（HRP标记的羊抗鼠IgG抗体）与存在于MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结合，HRP酶催化OPD，使无色底物形成橙黄色化合物，再由ELISA检测仪测定吸光度值，从而获得中和抗体滴度[11]。

1974年Jenning等首先用ELISA对注射流感病毒所产生的抗体消长规律进行了检测。Lanbre认为ELISA的敏感性远高于HI补给结合反应 。Meulemans(1987)对ELISA、AGP、HI检测AIV抗体进行了比较研究。发现AGP和ELISA一样均能检测型特异性抗原(抗体)，但敏感性远低于ELISA，HI适用于亚型的检测，其敏感性不如ELISA。1993 年Shodihall用混合纤维素脂膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板，建立了快速诊断的DAS－ELISA大大缩短了诊断时间，并可保留ELISA的特异性、敏感性，其结果又不需要特殊仪器分析、可用肉眼判定。

随着分子生物技术的发展，中国农业科学院哈尔滨兽研所的李海燕等用表达禽流感病毒核蛋白的杆状病毒感染S9昆虫细胞，以其表达产物制备抗原，建立了以杆状病毒系统表达的AIV核蛋白为抗原的禽流感间接(重组核蛋白)ELISA诊断技术(rNP－ELISA)确定了其最适工作条件，并对3138份鸡血清进行了检测。实验证明rNP－ELISA与全病毒间接ELISA(AIV－ELISA)，AGP及HI的符合率分别为99.9%、97.8%、98.8%，并能100%检出AGP阳性及疑似HI阳性的血清样品。 这证明了rNP－ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快捷、经济的血清学诊断技术[11]。

ELISA方法的敏感性和特异性与抗原的纯度直接相关 。1984年Abraham等报道了抗原快速提纯法，所需时间比常规法缩短10倍，并且研究结果表明应用提纯抗原几乎全部排除了假阳性反应。

目前美国Kiregard Reery和Labortories有试剂盒出售。ELISA成为AI流行病学普查及早期快速诊的最有效和最实用的方法。

3 分子生物学技术

近年来，随着现代生物技术的发展，分子生物技术已被大量应用于禽流感的快速诊断。

3.1聚合酶链反应(PCR)及反转录---聚合酶链反应(RT—PCR)

PCR是近来发展成熟起来的一种体外基因扩增技术，能在数小时内使DNA呈指数增加。已成功地用于多种病毒的基因检测和分子流行病学调查等其检测原理为：寻找传染性因子的特异DNA序列。对待测样品进行PCR扩增， 如果检测出了相应的扩增带，则判为阳性反应；反之，无扩增带则为阴性反应。

鉴于引起致病的禽流感病毒多是H5和H9血清亚型，在PCR技术的基础上，崔尚金等(1998)建立了一种直接检测禽粪样和鸡胚尿囊液中AIV—H9亚型RNA的RT－PCR反应，并将此法与AGP和电镜技术作了比较，结果表明引物的特异性决定了产物的特异性，并且该方法灵敏度高，检测过程仅需8h左右，并且大大缩短了感染后的检出时间。

应用毛细管PCR(15min30个循环)代替常规PCR(2.5个小时30个循环)以进一步缩短检测时间的研究也已展开并进入更深入的领域，以期用于不同样品(组织、组织液、分泌液、粪便等)的检测，区分高致病力毒株和低致病力毒株与非致病力毒株，从而深入探讨该方法在AIV的临床早期诊断，流行病学调查及发病机制中的应用价值，为我国制定AIV的综合防制措施做出贡献[12]。

3.2 核酸探针技术/核酸分子杂交技术

这项技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一，是定性和定量检测特异DNA或RNA的有力工具。

核酸探针技术的原理，在进行杂交时，用一种预先分离纯化的已知DNA或RNA序列片段去检测末知的核酸样品，对作检测用的已知DNA或RNA序列片段加以标记的片段就称为核酸探针。作为核酸探针的DNA或RNA是各种病原微生物基因的一部分。 在变性分开的待检DNA或RNA单链中加入与其有互补作用的核酸探针。探针在一定条件下就能与原来变性分开的DNA或RNA单链上的互补区段形成氢键，从而结合成杂交双链，通过洗涤，除去未杂交上的标记物，然后进行放射自显影，即可确定原待检样品有无与探针互补的DNA或RNA序列。

Bashiruddin等(1991)报道了扩增HA基因来分析致病毒株与非致病毒株的差异，证实了致病毒株与非致病毒株氨基酸的差异，显示了本方法的应用前景[13]。

3.3荧光PCR法

利用生物学手段，用荧光PCR方法快速检测禽流感病毒的方法已在北京通过专家鉴定，这一研究成果不仅在国内属于首次，而且在国际上也属于先进水平。它与国际标准方法鸡胚病毒分离相比，不仅无需做鸡胚病毒分离培养，而且时间也由原来最短的21d缩短为4h。

4 电镜技术

由于流感病毒为正粘病毒，属于形态特征性强的病毒,因而可用电镜技术来诊断。为提高禽流感的检出率，除样品制备技术外，取病料的部位和时间也是获得准确检验结果的关键。病料的采集部位及取材时间应根据禽流感病毒在动物体内分布特征及其感染特性而定[15]。

5 流感实验室检测中应注意的若干问题（高致病性流感病毒）

（1）禁止在同一实验室，更不应在同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本、已知阳性标本

（2）禁止在同一实验室，同一时间处理，接种采自不同动物的标本；动物标本（如禽、猪等）必须与人的标本分别保存。

（3）接种后剩余原始标本，尤其分离出病毒的标本需暂时冻存，有条件的应置-70℃或以下保存，以便需要时可进行复查，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。分离阴性的标本应随时弃之。

（4）严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。

（5）向国家流感中心送毒株时，量至少需5 ml，同时需自己保存一些，以便寄送过程发生意外时可继续补送。

（6）流感病毒在-20℃～-40℃ 时不稳定，故不宜在此温度下长期保存。

（7）鸡胚中分离出的流感病毒，应尽量别在MDCK细胞上传代。因当今国内所用的MDCK细胞属肿瘤细胞系，一旦病毒通过它传代就无法用于疫苗制备。

（8）寄送毒株时一定需附上送检表。寄送毒株需及时，尤其鉴定不出的，异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。寄送时用快速直送国家流感中心[16]。

总结

使用常规方法检测禽流感及其抗体仍是目前世界上普遍接受的方法。这些方法包括病毒的分离、琼脂扩散实验鉴定病毒和测定特异性的血清抗体，血细胞凝集及其抑制试验鉴定病毒或血清抗体亚型。 采用鸡胚中和试验来鉴定病毒或血清抗体亚型也是一种可以接受的方法，但相对血凝抑制试验较为麻烦。随着科学技术的发展，检测该病毒和血清的方法出现了免疫光法和ELISA法，这些方都有快捷的特点，特别是日益完善并趋向成熟的ELISA检测方法,因其简捷、敏感、特异性强等优点而越来越得到广泛的重视和应用。随着分子生物学的发展，核酸序列分析法越来越可能成为一种更准确可行的方法,特别是它能从分子生物学的发展，核酸序列分析法越来越可能成为一种更准确可行的方法，特别是它能从分子水平揭示HPAIV甚至潜在HPAIV毒株。这种方法虽然在一般实验室还不能应用,但RT－PCR技术为从基因水平检测禽流感病毒RNA提供了灵敏、特异和快捷准确的方法。正在进行的应用毛细管PCR代替常规PCR，以进一步缩短检测时间的研究和根据禽流感NP的高度保守性而建立的rNP－ELISA检测法，不仅具有与AGP、HI同样的特异性，而且具有更高的灵敏性，可在微克水平上进行检测!都是很有前途的方法。将rNP－ELISA检测技术及其成套的成品试剂组装成诊断试剂盒，也取得了很好的实验效果。

在以上各种检测方法及科学技术发展的基础上，将PCR技术与ELISA技术结合起来，建立一种新的实验室检测AIV的方法，将有较大的研究价值其实。其实验原理（以此类方法中最简单的双引物双标记法为例）如下：

PCR的一对引物中!其中一种引物用生物素标记，另一种引物用地高辛标记，酶标微孔板上用生物素的亲和素包被(生物素的亲和素与生物素特异的结合)。PCR扩增后纯化片段加入微孔板中。此时，微孔板上包被的生物素亲和素将与引物上的生物素结合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将与另一引物上的地高辛结合，从而形成生物素亲和素－生物素－PCR片段地－高辛－抗地高辛－酶的复合物。加入酶的相应底物进行显色，便可判断PCR扩增的有无。由于该方法是PCR技术和ELISA技术的结合，所以它是一种两级放大系统,即PCR放大和ELISA放大。故而它的灵敏度更高，同时这种方法避免了PCR产物分析时的电极及染色过程，所以更为快捷、简便、灵敏。

Ⅹ 纳米金 是什么意思

纳米金即指金的微小颗粒，其直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。由氯金酸通过还原法可以方便地制备各种不同粒径的纳米金，其颜色依直径大小而呈红色至紫色。
以纳米金为免疫标记物的检测技术的发展
作为现代四大标记技术之一的纳米金标记技术(nanogold labelling techique)，实质上是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是纳米金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，而且吸附后不会使生物分子变性，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。由于球形的纳米金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共价结合，因而在基础研究和实验中成为非常有用的工具。
1．1 作为显微镜示踪物
1978年，Geobegan等将纳米金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色(immunogold staining，IGS)。1981年 Danscher用银显影方法增强金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。Holgate等人于1983年建立了用银显影液光镜下金颗粒的可见性的免疫金银染色法(immunogold-siliver staining，IGSS)，利用银的增强作用，加大单独金粒子在光镜下可视粒子的半径，增加了小颗粒金粒子的标记密度，提高了灵敏度。1986年Fritz等人又在IGSS法基础上成功地进行了彩色IGSS法，使得结果更加鲜艳夺目。尽管如此，由于亚硝酸银化合物是光敏性的，需要在暗室里进行标记，实验操作非常的不便，改用非光敏的醋酸银化合物，价格又过于昂贵，所以纳米金在光镜中的应用日渐减少。而利用纳米金的高电子密度，能在电镜下清晰的分辨颗粒，作为在透射电镜(TEM)、扫描电镜(sEM)和荧光显微镜的示踪物在电镜免疫化学和组织化学中得到了广泛应用。
1．2 应用于均相溶胶颗粒免疫测定技术
均相溶胶颗粒免疫测定法(sol particle immunoassay， SPIA)是利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，将纳米金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。
l.3 应用于流式细胞仪
应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪(Flow CytoMeter，FCM)计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记很困难。Boehmer等研究发现，纳米金可以明显改变红色激光的散射角，利用纳米金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果纳米金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。因此，纳米金可作为多参数细胞分析和分选的有效标记物，分析各类细胞表面标志和细胞内含物。
1．4 应用于斑点免疫金银染色技术
斑点免疫金银染色法(Dot-IGS，IGSS)是将斑点ELISA与免疫纳米金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加纳米金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法(Dot-IGS)。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法(Dot-IGS/IGSS)。
1．5 应用于免疫印迹技术
免疫印迹技术(immunoblotting，IBT)也称为免疫转印技术，其原理是根据各种抗原分子量大小不同，在电泳中行走的速度不同，因而在硝酸纤维素膜上占据的位置也不同；把含有特异性抗体的血清和这一薄膜反应，那么特异性的抗原抗体反应就显色。而纳米金免疫印迹技术相比酶标记免疫印迹技术具有简单、快速、具有相当高的灵敏度。而且应用纳米金将硝酸纤维素膜上未反应抗体进行染色，评估转膜效率，校正抗原一抗体反应的光密度曲线，即可进行定量免疫印迹测定。
1．6 应用于斑点金免疫渗滤测定技术
斑点金免疫渗滤测定法(dot immuno-gold filtration assay，DIGFA)是斑点免疫测定法(dot immunoboding assay，DIBA)中的一种，是1982年由Hawkes等人在免疫印迹技术基础上改良发展起来的一项免疫学新技术。其原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原(抗体)后，迅速加抗体(抗原)，再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。与斑点免疫渗滤测定法(d o t immunotietration assay，DIFA)相比，所不同的是免加底物液，直接由红色胶体金探针显色，结果鲜艳，背景更清楚，可以在室温下保存。该方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒(HI)的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。目前使用的有HCG试剂盒，AFP试剂盒，消化道肿瘤筛检试剂盒。
1．7 应用于免疫层析技术
免疫层析法(gold immunochromatography assay， GICA)是将各种反应试剂以条带状固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触，样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生特异性免疫反应。层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域(检测带)，通过可目测的纳米金标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。GICA特点是单一试剂，一步操作，全部试剂可在室温长期保存。这种新的方法将纳米金免疫检测试验推进到～个崭新的阶段。
1．8 生物传感器
生物传感器(biosensor)是指能感应(或响应)生物、化学量，并按一定规律将其转换成可用信号(包括电信号、光信号等)输出的器件或装置。在生物传感器方面，纳米金主要设计为免疫传感器，是利用生物体内抗原与抗体专一性结合而导致电化学变化设计而成。另外由于纳米金的氧化还原电位是+1．68V，具有极强的夺电子能力，能大大提高作为测定血糖的生物传感器葡萄糖氧化酶膜的活性，金颗粒越细，活性越大。
1．9 生物芯片
生物芯片是以膜、玻璃、硅等固相介质为载体，其最大的优点在于高通量、并行化、微型化。一次实验可同时检测多种或多份生物样品。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。目前，生物芯片用于食品安全检测领域的应用主要包括农药、兽药残留检测，食品微生物检测、动物疫病监测、转基因动物植物检测等。2002年Park等在《Science》杂志上介绍了一种以纳米金为探针的基于电荷检测的新型基因芯片，该芯片具有非常好的灵敏度及特异性，可以在十万分之一比率中检测出单碱基突变的基因片段。
纳米金技术在食品安全快速检测中的应用
目前食品检测分析一般采用化学分析法(CA)、薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)，但需要繁琐、耗时的前处理，样品损失也较大。相对于灵敏度较低的CA和TLC方法，GC、HPLC的灵敏度较高，但操作技术要求高、仪器昂贵，并不适合现场快速测定和普及，而以纳米金为免疫标记物的检测技术正弥补了这些技术的缺点，在现代食品分析检测中的运用也越来越多。
2．1 兽药残留
所谓兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及，或其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。兽药残留既包括原药也包括药物在动物体内的代谢产物。主要的残留兽药有抗生素类、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫药、激素药类和驱虫药类。兽药通常是通过在预防和治疗动物疾病用药、在饲料添加剂中使用以及在食品保鲜中引入药物而带来对食品的污染。人长期摄入含兽药的动物性食品后，不但会对人体产生毒性作用，出现过敏反应，而且动物体内的耐药菌株可传播给人体，当人体发生疾病时，就给临床上感染性疾病的治疗带来一定的困难，延误正常的治疗。另外有些残留物还具有致畸、致癌、致突变作用。
Verheijen利用胶体金标记纯化的抗链霉素单克隆抗体，对链霉素的检测限为160ng/ml，检测方便快速，不需要其他试剂和仪器，时间仅需lOmintl41。而使用胶体金免疫层析试纸条，在检测虾肉等组织试样中残留氯霉素(chloramphenicol，CAP)残留时，灵敏度可达到 lng/ml，只需5～10min，并且与类似物没有交叉反应。Yong Jin等也使用金标法来检测动物血浆和牛奶中的新霉素残留，其检测限为10ng/mltl6J。盐酸克伦特罗即β2受体兴奋剂，俗称“瘦肉精”能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，若在畜牧生产中使用，可明显提高饲料转化率和瘦肉率；但使用剂量过大，则会对动物和人(间接)的肝脏、肾脏等器官产生严重的毒副作用。尽管欧盟于1996年禁止在畜牧生产中使用该药(EC Direc． tive 96/22/EC)，我国农业部也于1997年明令禁止，但国内“瘦肉精”中毒事件时有发生。刘见使用金标试纸法快速检测检测盐酸克伦特罗，最小检测量达到40ng/ml。现在商品化的试纸条产品现在也比较成熟，比利时UCB Bio-procts公司开发的Tlhe Beta STAR检测法就是将特定的β-内酰胺受体固定在试纸条上，用胶体金有色微粒作为标记物，5min内可以检测到青霉素和头孢霉素残留。而国内的刘平在用生物电化学传感器检测牛奶中残留的青霉素时，认为使用纳米金将有助于提高传感器的检测限。
2.2 动物传染病
动物传染病不但会影响动物养殖经济，也对人类健康构成威胁，联合国粮农组织和世界卫生组织已把预防和控制严重的动物流行病作为其工作重点之一。虾白斑病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是阻碍虾养殖业发展的主要因素，至今还没有有效的药物，所以及早检测出病毒，显得尤其重要。Wang Xiaojie等已成功研究了斑点免疫金渗滤法(DIGFA)t19~和金标试纸法来检测虾白斑病毒，其中金标试纸法的检测限为1 μg/ml，而使用银增强，可以达到0．0lμg/ml。赖清金等使用金标试纸条来检测猪瘟病毒，10～15min就能检出结果，并可根据检测结果合理指导猪瘟免疫和建立适宜的免疫程序。禽流感病毒(AIV)是引起禽类急性死亡的烈性、病毒性传染病，而且能感染人，我国许多地区也先后报道有高致病性禽流感的发生，给养禽业造成了重大的经济损失，也严重威胁了人类的健康。刘永德等将兔抗禽流感H5、H9亚型病毒抗体纯化后，分别与制备的胶体金研制成免疫金探针，用改良的渗滤法安全快速地检测被检材料中禽流感H5、H9亚型病毒，3min即可得到结果，检测灵敏度分别为1．62ug/ml和1．25μg/ml。
2.3 农药残留
农药残留分析的困难包括：样品基质背景复杂、前处理过程繁琐，需要耗费较多的时间、被测成分浓度较低、分析仪器的定性能力受到限制、仪器检测灵敏度不够等一系列问题，但使用金标记的快速检测可以很好的解决以上问题。国内的王朔分别使用纳米金免疫层析和纳米金渗滤法检测西维因的残留，整个检测过程只需5min，检测限也分别达到100ug/L和50μg/L。国内的生物技术公司也开发出了成熟的商品化产品，如克百威农残速测试纸条等。
2．4 致病微生物检测
目前基于金标记的快速检测研究在致病微生物方面比较多，检测的种类也比较多。最早Hasan以免疫磁性分离技术为基础的免疫胶体金技术已成功应用于01群霍乱弧菌(Vibriocholerae)的检测。国内洪帮兴等人研究了以硝酸纤维膜为载体纳米金显色的寡核苷酸芯片技术，为在分子水平快速简便的鉴别致病菌提供了可能，甚至可以检出致病菌的耐药性变异。该芯片技术对大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌和空肠弯曲菌等10种(属)具有高灵敏度和特异性，检出水平可达10CFU/mlt251。殷涌光等在使用集成化手持式Spreeta TM SPR传感器快速检测大肠杆菌时，引入胶体金复合抗体作为二次抗体大幅度增加质量，进一步扩大了检测信号，同时延长胶体金复合抗体与微生物的结合过程，使检测信号进一步稳定与放大，从而显着提高了检测精度，使该传感器对大肠杆菌的检测精度由10 6 CFU/ml提高到10 1CFU/ml。金免疫渗滤法重要的食源性致病菌之一大肠埃希氏菌0157：H7，目前的检测通常先以山梨醇麦康凯琼脂(sMAC)进行初筛，然后用生化和血清学试验做鉴定，一般需要24～48h，而采用胶体金免疫渗滤法检测却非常的简便，在很短时间即可得到结果。
在致病菌快速检测中金标试纸条的研究越来越广泛。谢昭聪等应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究中，增菌液霍乱弧菌含量为1CFU/ml，通过增菌12h后，即可应用胶体金免疫层析法诊断试剂检出，而一般水产品霍乱弧菌检测所采用的传统常规方法，检测时限长，增菌培养需8～16h，分离培养需14～20h，初步报告需30h以上，实际操作中，需要3d以上才能出报告。肠杆菌科的大属沙门氏菌可引起人的沙门氏菌性食物中毒，王中民等人采用免疫渗滤法可检出85%的引起食物中毒的沙门氏菌，灵敏度为2．4×107CFU/ml，对最常见的鼠伤寒、猪霍乱和肠炎沙门氏菌，检出率达100%，而采用胶体金免疫层析法的灵敏度为2．1×106CFU/mlt30j。被美国列为七种主要食源性致死病菌之一的李斯特菌，如果按照传统的分离培养和鉴定技术需要l～2周时间，而采用免疫胶体金层析法只需10min就能得到检测结果，灵敏度达到87．5%。
2．5 真菌毒素的检测
真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌(Fungi)产生的具有毒性的二级代谢产物，广泛存在食品和饲料中，人类若误食受污染的食品，就会中毒或诱发一定疾病，甚至癌症。检测食品中的真菌毒素常用理化方法或生物学方法。但理化法需要较昂贵的仪器设备，操作复杂。而运用免疫技术检测真菌毒素敏感性高，特异性强，非常适用于食物样品的检测。D．J．Chiao等使用金标免疫层析法在10min之内即可检测50ng/ml的肉毒杆菌毒素B(BoNT/B)，如果使用银增强则其检测限可以达到50pg/ml，而且对A、E型肉毒杆菌毒素没有交叉反应。貉曲霉毒素是曲霉属和青霉属产生的一类真菌毒素，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉素A(OTA)，赖卫华等研制的赭曲霉毒素A快速检测胶体金试纸条，检测限达到了10ng/mlt331，远远低于目前我国对赭曲霉毒素的限量要求5μg/L。黄曲霉毒素B z的快速检测国内也有很多研究，孙秀兰研制的黄曲霉毒素B，金标免疫试纸条，其最低检测限达到2．5ng/ml，而且能定性或半定量检测食品中的黄曲霉毒素B，含量。
小 结
随着科学技术的不断发展，食品分析检测技术也在不断地更新、完善和迅速发展，尤其是快速检测技术更能适应现代高效、快速的节奏和满足社会的要求。仪器分析法可以保证数据的精确性和准确性，但其流程仍比较烦琐。尽管以纳米金为标记物的免疫分析法及其它速测技术的开发过程需投入较多资金和较长时间，但具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、价廉、样品所需量少等优点，其灵敏度与常规的仪器分析一致，适合现场筛选，而且其中的金免疫层析技术正在向定量、半定量检测和多元检测的方向发展，更加体现出金标技术的优势。总之，快速检测技术的快速、灵敏、简便等优点，使之在食品卫生检疫和环境检测中有着广泛的应用价值和发展前景。

应用领域
食品、玻璃、生物体的着色剂。
用于遗传基因的鉴定技术。
用于环境净化产品的提炼。
用于食品、化妆品的防腐剂。
加入到化妆品中起到美白、抗衰老、润肤的作用。
生产抗菌、抑菌、消炎类药品，医疗器械，保健用品，美容护理器械。
生产与人们生活息息相关的各类生活日用品、食品、饮品等。如纳米金香皂，牙刷，各种美容面膜。