布鲁氏茵快速核酸检测方法的建立

‘壹’ 布鲁氏杆菌病

是由布氏杆菌引起的人畜共患传染病。以母畜流产、不孕和公畜睾丸炎为特征。OIE将其列为B类疫病。

1 病原学
布氏杆菌属，为革兰氏阴性小杆菌，不形成芽胞。根据其病原性、生化特性等不同，可分为6个种20个生物型，其中羊种布鲁氏菌3个型、牛种布鲁氏菌9个型、猪种布鲁氏菌5个型，还有犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌和沙林鼠种布鲁氏菌。
布氏杆菌对各种物理和化学因子比较敏感。巴氏消毒法可以杀灭该菌，70℃10分钟也可杀死，高压消毒瞬间即亡。对寒冷的抵抗力较强，低温下可存活1个月左右。该菌对消毒剂较敏感，2％来苏儿3分钟之内即可杀死。该菌在自然界的生存力受气温、湿度、酸碱度影响较大，pH7.0及低温下存活时间较长。

2 流行病学

布氏杆菌病广泛地分布于世界各地，能侵害多种家畜、野生动物和人类。家畜的感染总体上可分为两种类型：单一感染型和交差感染型。前者指家畜感染本种布氏杆菌，后者指由于牛、羊群共同放牧，通过相互间的接触造成羊群既感染羊种布氏杆菌又感染牛种菌，或牛群既感染牛种菌又感染羊种菌等。山羊和绵羊对羊种布氏杆菌最易感。牛对牛种菌易感，也可感染羊种菌和猪种菌。猪对猪种菌和羊种菌均易感。马和犬对羊、牛、猪三种布氏杆菌都有易感性，鹿对牛种菌和羊种菌易感。人类可以感染布氏杆菌。
病畜和带菌动物，特别是流产母畜是最危险的传染源。病菌存在于流产的胎儿、胎衣、羊水及阴道分泌物中。病畜乳汁或精液中也有病菌存在。
本病主要经消化道感染，也可经伤口、皮肤和呼吸道、眼结膜和生殖器黏膜感染。因配种致使生殖系统黏膜感染尤为常见。
本病一年四季均可发生，但有明显的季节性。羊种布氏杆菌病春季开始，夏季达高峰，秋季下降；牛种布氏杆菌病以夏秋季节发病率较高。

3 临床症状

本病潜伏期长短不一，牛布氏杆菌病一般在14～120天之间。潜伏期的长短，视病原菌的毒力、感染量及感染时母牛的妊娠期而定。
母牛主要表现流产，可发生于妊娠的任何时期，多见于6～8个月。多见胎盘滞留，失去生育能力。公牛出现睾丸炎及附睾炎。有些牛发生关节炎、黏液囊炎和跛行。
绵羊和山羊常见流产和乳房炎。怀孕母羊易感染，常发生胎盘炎，引起流产和死胎。流产发生于妊娠后的3～4月。母山羊常常连续发生2～3次流产。公山羊生殖道感染则发生睾丸炎。有的病羊出现跛行、咳嗽。绵羊副睾种布鲁氏菌感染其症状局限于副睾，常引起附睾肿大和硬结。非怀孕母羊也可感染，但一般是一过性的。
猪的明显症状也是流产。出现暂时性或永久性不育、睾丸炎、跛行、后肢麻痹、脊椎炎，偶尔发生子宫炎、后肢或其他部位出现溃疡。
犬可感染牛种、羊种和猪种布鲁氏菌，但多为隐性感染，呈散发性，少数出现发热。感染犬种布鲁氏菌的母犬，妊娠40～50天发生流产，产死胎和出现不育症，淋巴结肿大。公犬常发生副睾炎、前列腺炎和菌血症。
马可感染布氏杆菌的各个种，尤其对牛种和猪种菌最易感。多呈隐性感染，有的发生化脓性滑液囊炎，尤其在头部和肩部，常见“马肩瘘管”或“马颈背疮”。

4 病理变化

布氏杆菌最适宜在胎盘、胎衣组织中生长繁殖，其次是乳腺组织、淋巴结、骨髓、关节、腱鞘、滑液囊以及睾丸、附睾、精囊等。
特征病变是胎膜水肿，严重充血或有出血点。子宫黏膜出现卡他性或化脓性炎症及脓肿病变。常见有输卵管炎、卵巢炎或乳房炎。公畜精囊中常有出血和坏死病灶，睾丸和附睾肿大，出现脓性和坏死病灶。

5 诊断

5．1 根据临床症状和病理变化可做出初步诊断，确诊需进一步做实验室诊断。
5．2 实验室诊断
在国际贸易中，指定诊断方法为缓冲布氏杆菌抗原试验(BBAT)、补体结合试验和酶联免疫吸附试验。替代诊断方法为荧光偏振测定法(FPA)。
病原检查：抹片镜检(取病畜胎盘绒毛膜表面及水肿区边缘触片染色镜检)、分离培养、动物试验。
血清学检查：缓冲布氏杆菌抗原试验(虎红平板凝集试验、缓冲布氏杆菌平板凝集试验)、补体结合试验(特异性高，但操作繁琐)、间接酶联免疫吸附试验、竞争酶联免疫吸附试验、全乳环状试验(可用于筛选病畜群)、血清凝集试验、布氏杆菌素试验(适用于流行病学调查，由于其敏感性低，不能单独作为正式的诊断试验)。
病料采集：通常采取流产胎儿、胎盘、阴道分泌物或乳汁。
5．3 鉴别诊断
应与弯杆菌病、沙门氏菌病、钩端螺旋体病、乙型脑炎、衣原体病和弓形虫病等有流产症状的疫病鉴别。

6 防治

坚持自繁自养。必须引进种畜时，要严格检疫2次，确认健康者才能混群。
在疫区，每年定期以凝集反应检疫2次，清净群每年至少检疫1次，检出病畜应扑杀并做无害化处理。阴性反应畜可预防接种菌苗进行预防。
被污染的畜舍、运动场、饲槽、水槽等用10％石灰乳或5％热火碱水严格消毒；病畜分泌物、排泄物等应做无害化处理或消毒深埋。
兽医、病畜管理人员、接羔员、屠宰加工人员，要严守卫生防护制度，特别在产仔季节更要注意。最好在从事这些工作前1个月进行预防接种，且需年年进行。

‘贰’ 牛布病的检测方法都有哪些（至少四种）

吃没熟透的肉可能染上
布鲁氏菌
，这种细菌可能会导致持续性高热、
不规则热
或长期低热，同时伴有关节肌肉疼痛、乏力、多汗等。在温度高到70℃以上这种细菌就不能存活，因此建议吃肉时务必熟透后再吃。

‘叁’ 疫情期间什么是双抗检测

目的建立一种高特异性、敏感性的ELISA方法检测人布鲁氏菌抗原。方法应用研制的针对羊布鲁氏菌O链M抗原的单克隆抗体2D10和牛布鲁氏菌O链A抗原的单克隆抗体4B8建立了用于检测人布鲁氏菌抗原的双抗夹心ELISA方法。结果经检验该方法不与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9及鼠伤寒沙门氏菌发生交叉反应,具有较好的重复性,对阳性样品的检测ELISA与SAT、分离培养的符合率均为100%。结论建立了高特异性、敏感性的检测人布鲁氏菌抗原的ELISA方法

‘肆’ 实验室检测家畜布氏杆菌病的方法主要有哪些

1．血象白细胞半数正常或轻度减少，淋巴细胞相对或绝对增多，分类可达60%以上。血沉在各期均增速。久病者有轻或中度贫血。 2．细菌学检查患者血液、骨髓、乳汁、子宫分泌物均可做细菌培养。因牛种菌初分离困难。要求严格的环境，故各种标本最好采集两份，一份用含肝浸液的肉汤做培基，在CO2孵箱中培养；另一份放一般环境中孵育，培养时间不得短于2周。急性期阳性率高，慢性期低。骨髓标本较血液标本阳性率高。有人建议慢性布鲁氏菌病患者的血液接种到鸡胚卵黄中可获较高阳性率。 3．免疫学检查 （1）血清凝集试验（Wright试验）试管法较灵敏。患者多在第二周出现阳性反应，1：100以上有诊断价值。病程中效价递增4倍及以上意义更大。正常人可有低滴度的凝集素；某些传染病的假阳性率可达30%以上，如兔热病该凝集效价升高；注射霍乱疫苗的人90%可呈假阳性；接种布鲁氏菌活菌苗者，凝集效价也增高。诊断时要注意分析。另外由于抗体IgA、IgG、IgM量的比例不同，如IgA含量高则可出现患者血清低稀释度为阴性，高稀释度反为阳性的所谓前带现象。因此做该实验时应增大患者血清稀释范围。 （2）补体结合试验补体结合抗体主要为IgG，出现较迟，持续较久，一般1：16以上即为阳性。对慢性患者有较高特异性。 （3）抗人球蛋白试验（Coombs’tist）用于测定血清中的不完全抗体。不全抗体可阻断完全抗体与抗原的凝集反应，使凝集试验呈假阴性。Coombs试验是使不完全抗体与不可见抗原结合的复合物通过抗人球蛋白血清结合成块，直接可见。故凝集试验阴性者可作此检查。

‘伍’ 布鲁氏菌的发现历史

1814年Burnet首先描述地中海弛张热，并与疟疾作了鉴别。
1860年Marston对地中海弛张热作了系统描述，且将其与伤寒相区别。
1886年英国军医Bruce在马尔他岛从死于“马尔他热”的士兵脾脏中分离出“布鲁氏菌”，首次明确了地中海弛张热的病原体。
1897年Hughes根据地中海弛张热的热型特征，建议称“波浪热”。为纪念Bruce，学者们建议将该病取名为“布鲁氏菌病”。
1897年Wright与其同事发现病人血清与布鲁氏菌的培养物可发生凝集反应，称为Wright凝集反应，从而建立了迄今仍用的血清学诊断方法。
1897年丹麦Bang和1912年美国学者Traum分别从流产母牛的羊水和猪流产胎儿分离到牛种布鲁氏菌和猪布鲁氏菌(B.suis)。
1920年由Meyer将牛、羊和猪三种菌同归于布鲁氏菌属。
1921年南非的Bevan和1924年Keefer，以及Viviani在意大利，Evans在北美从病人身上分离到牛种和猪种布鲁氏菌，从而在流行病学上首次证实了病牛和病猪是人布鲁氏菌病的另两种传染源。
1953年、1956年和1966年，Buddle、Stoenne、Canmichael又分别发现了绵羊布鲁氏菌、沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)。
2007年英国科学家从海洋哺乳动物体内分离到鲸型布鲁氏菌(B.ceti)和鳍型布鲁氏菌(B.pinnipedialis)。
2008年，德国和捷克科学家又发现了田鼠种布鲁氏菌(B.microti)。

‘陆’ 布鲁氏菌治疗方法是什么

采用抗生素类药物

四环素类抗生素，并用链霉素治疗：四环素每日2克，分四次口服，21天为一疗程，可重复1～2个疗程，疗程间隔5～7天。第一疗程时并用链霉素。成人每日1克，他两次肌肉注射。

利福平，并用强力霉素治疗：利福平成人每天600～900毫克，分两次口服，并且每天早晨口服强力霉素200毫克，连服6周。

磺胺治疗：复方新诺明成人每次2片口服，每日3次，连服2周，以后每天2次。3周为一疗程，可治2～3个疗程，疗程间的间隔5～7天。用此类药治疗后有一定复发率。

对症治疗：除抗生素治疗外，应以对症治疗。如失眠者可服用镇静药，关节痛、头痛等可服镇痛药，高烧者可辅以物理降温或服解热药等。

对慢性布病无特效药物治疗。我国一般采用中医中药治疗。因慢性期病人的症状复杂，不同人表现不同。有的以过敏症状为主，有的以内分泌紊乱为主，更有的免疫功能低下等。医生应依不同情况予以适当治疗。

‘柒’ 布鲁氏菌的具体研究

布鲁氏菌部分外膜蛋白基因的克隆、表达及免疫原性研究
中文摘要:布鲁氏菌是革兰氏阴性的兼性细胞内寄生菌，可以引发世界范围内人和牲畜及野生哺乳动物的感染，也是生物武器研究的热点。布鲁氏菌引发的传染性疾病和巨大的经济损失已经引起全世界的关注。 常用布鲁氏菌疫苗功能基因序列分析及AMOS检测方法研究
中文摘要：试验内容,AMOS-PCR是一种能够鉴别诊断布鲁氏菌病原的一种PCR方法,本试验中对其分型鉴定进行了研究。对我国常用疫苗S2、M5、S19、104M使用该方法，并做单一基因的AMOS-P.... 布鲁氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及检测试剂盒的组装
中文摘要: 本研究以布鲁氏菌(Brucella)基因组编码31kDa核周质蛋白的BCSP31基因设计了布鲁氏菌属荧光定量PCR特异性引物和Taqman荧光探针，优化了荧光定量PCR反应体系和条件。
布鲁氏菌BLS-L7/L12重组亚单位疫苗的初步研究
中文摘要：布鲁氏菌病(Brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella．spp)引起的人、畜共患传染病。世界上有170多个国家和地区有人、畜布病存在和流行。在我国布病已波及28个....
布鲁氏菌种特异性抗原抗体免疫胶体金试纸条的研制及初步应用
中文摘要: 将牛布鲁氏菌杂交瘤细胞株4B8、1C9、1G9、1E2和羊布鲁氏菌杂交瘤细胞株3C6、2D10、1E10扩大培养,制备单克隆抗体。纯化后抗体非特异带消失,抗体效价为1×106万....
布鲁氏菌种特异性单克隆抗体的研制和抗原捕捉ELISA方法的建立
中文摘要: 本研究选用两株光滑型布鲁氏菌B.abortus 544A和B.melitensis 16M,采用热酚法和酚-甲醇法提取纯化了二者的LPS和O链抗原，选择SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖....
布鲁氏菌新型疫苗的构建及其免疫原性研究
中文摘要: 布鲁氏菌病（Brucellosis）是由细胞内寄生的革兰氏阴性小杆菌布鲁氏菌引起的一种人畜共患病。它以发热，流产为主要症状，严重威胁着人畜健康。全世界每年出现500,000例人布鲁氏菌病....
白城地区布鲁氏菌病的流行病学调查及病原学研究
中文摘要：布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种人畜共患疾病,流行于世界160多个国家。“近年来在我国畜牧业发展地区”，布鲁氏菌病在人、畜间疫情愈演愈烈，范围逐渐扩大，呈暴发和流行态势，仅2006....
树突状细胞在布鲁氏菌疫苗诱导免疫应答中的作用研究
中文摘要:：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种耸薰不即静主要经消化道、呼吸道和泌尿生殖黏膜以及皮肤伤口感染,引起母畜流产和人的“波浪热”等疾病。
大量研究证明：巨噬细胞是布鲁氏菌的易感细胞。
奶牛布鲁氏菌的PCR检测与分子分型研究
中文摘要: 为了调查奶牛布鲁氏菌病的流行和发病情况,本研究利用虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)对浙江省奶牛养殖较为集中的金华地区30个奶牛场28243头奶牛进行布鲁氏菌病原普查,结....
布鲁氏菌外膜蛋白Omp39和Omp14的原核表达及其免疫原性鉴定
中文摘要：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由细胞内寄生的革兰氏阴性布鲁氏菌引起的一种人畜共患病。临床上以发热,流产为主要症状,严重威胁着人畜健康。据世界卫生组织统计表明,全世界每年出现50万....
牛、羊布鲁氏菌单克隆抗体乳胶凝集试验检测方法的建立及初步应用
中文摘要: 参考已报导LPS和O-侧链的提取方法，热酚法、冷酚法。对牛布鲁氏菌(B.abortus 544A)、羊布鲁氏菌(B.melitensis 16M)的LPS和O-侧链进行了提取纯化鉴定。
羊布鲁氏菌是革兰氏阴性需氧杆菌。分类上属于布鲁氏菌属,为非抗酸性,无芽孢,无荚膜,无鞭毛呈球杆状。组织涂片或渗出液中常集结成团,且可见于细胞内，培养物中多单个排列。布鲁氏菌在皮肤里能生存45～60天,土壤中存活40天，乳中存活数周。
对热抵抗力弱，一般消毒药能很快将其杀死。 布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△YZ-2的研究
中文摘要: 当前布鲁氏菌疫苗种类繁多,但各有缺陷。比如不能区分人与动物是人工免疫接种还是野生菌感染,并且病毒强,返祖现象严重,甚至使接种的人与动物发病,而不能广泛应用,致使当前布鲁氏菌病趋年上升。 ....
布鲁氏菌的脂肪酸分型研究
中文摘要: 目的获得布鲁氏菌脂肪酸成分的数据资料,探索脂肪酸分型方法对布鲁氏菌进行分型的可能性。 方法选择布鲁氏菌的19个标准株、7个疫苗株、64个野毒株,经化学方法提取菌体脂肪酸后，用气相....

‘捌’ 影响布病虎红平板凝集实验因素有哪些

由于布鲁氏菌培养的营养条件苛刻而且时间长，所以布鲁氏菌病的诊断以血清学诊断为主。其原理主要是根据相应抗原抗体可以在体外发生特异性结合并呈现可见反应，用已知抗原(或抗体)检测体液中未知的抗体(或抗原)。
虎红平板凝集试验（RBPT）灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。
检测布鲁氏菌病所用的虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体用虎红染料染色后，悬浮于乳酸缓冲液中制备而成。

试验原理：虎红平板凝集试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。由于所用的抗原是酸性（PH3.6-3.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性、检查的抗体是IgG类，因此提高了反应的特异性。
虎红平板凝集试验具体方法如下：
一、材料准备
1、虎红平板凝集抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。
2、被检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。
3、洁净的玻片或玻璃板，其上划分成4cm2的方格。
4、吸管或移液器，适于滴加0.03mL液体。
5、牙签、混合棒或火柴杆，供搅拌用。
二、操作方法
1、实验前，应将血清和抗原在室温放置30-60min。
2、将玻璃板上各格标记被检血清号，然后加相应被检血清0.03mL。
3、在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原0.03mL。
4、用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在5分钟内观察结果。
5、每次试验应设阴性血清、阳性血清对照。
三、结果判定
1、在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。
2、受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(-)。

四、方法评价
1、虎红平板凝集试验检测布鲁氏菌病，方法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检疫；
2、该方法敏感性较好，检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。
3、因为在酸性环境下IgM活性受抑，该法主要是检查IgG类凝集抗体，所以特异性较好，与补体结合试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白试验有较高的吻合率。
4、该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备抗原应予以检查、标化方可应用。

‘玖’ 怎么在相关检测布鲁氏菌的文献中查到基因序列和基因型，求求辽，急急急

摘要 布鲁氏菌历史菌株、近期分离菌株,检测分析16SrRNA基因序列,构建遗传进化树,为宁夏地区布鲁氏菌鉴定、传染源追溯和分子流行病学监测体系提供基础数据。方法利用传统生物学方法和分子生物学方法鉴定具有代表性的20株布鲁氏菌和参考菌株的种和生物型,从GeneBank下载与布鲁氏菌有共同抗原细菌的16SrRNA基因序列,并采用PCR扩增产物直接测序法对布鲁氏菌的16SrRNA扩增、测序,用DNAMAN软件进行序列拼接比对,构建遗传进化树。结果经传统生物学方法和分子生物学方法鉴定20株布鲁氏菌分别为羊种13株,牛种2株,猪种4株,犬种1株。布鲁氏菌历史菌株、近期分离菌株和部分参考菌株16SrRNA经PCR扩增均得到1 412 bp条带,所有菌株和布鲁氏菌有共同抗原细菌的16SrRNA经一致性分析,达到98.54%,进化树显示,选取的具有代表性的分离菌株与参考菌株在同一末端的分支上,遗传距离十分接近。布鲁氏菌与人苍白杆菌在进化树的同一次分支上,遗传距离为0.019,而与霍乱弧菌、大肠杆菌O∶157、耶尔森菌属O∶9的遗传距离较远,遗传距离均大于0.02。结论从遗传进化角度对布鲁氏菌分离株与标准菌株的亲缘关系进行分析,所有种型遗传距离接近,提示16SrRNA为高度保守序列,不宜做遗传进化分析的靶基因,可作为布鲁氏菌属的一个鉴定方法,布鲁氏菌与人苍白杆菌有较近的亲缘关系。