重组体筛选的方法和技巧

① 基因工程过程中筛选重组体的方式有什么和什么

一般有抗性筛选和蓝白斑显色筛选。

② 植物基因工程的内容(基因克隆方法、连接、转化、筛选及鉴定)

1）目的基因制备和分离：一般通过文库筛选、同源序列比对等方法进行克隆。
2）DNA重组载体的构建：选择植物表达载体，根据载体选择或添加酶切位点，然后进行酶切连接，构建重组载体。
3）转化：转化方法有多种：农杆菌法：将重组载体用电击或热激的方法将其转入农杆菌中，再用农杆菌侵染植物；基因枪法：将重组载体与金粉混合后用基因枪轰击组织块；此外还有其他一些方法。
4）植物阳性植株的筛选和鉴定：一般先用抗性初次筛选后，在基因水平上用PCR扩增目的片段或做Southern杂交；在RNA水平上做半定量或Nouthern杂交.
5）基因表达产物的分离纯化和鉴定：这是蛋白水平上的鉴定，一般是提取纯化蛋白，做蛋白分析。

③ DNA克隆的重组体的筛选

通 过转化、转染或感染，重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养板培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。由于每一重组体只携带某一段外源基因，而 转化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，如何将众多的转化菌落或转染噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基 因，这一过程即为筛选或选择。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法或非直接选择法。

④ 重组DNA的的鉴定方法有哪些

通过目的基因的特性来筛选、比如用青霉素或者其他抗性环境来择选载入成功的重组体、活下来的就是目的基因表达成功的、

⑤ 如何筛选含有重组体的阳性菌落

重组体一般会带有标志基因（报告基因）如抗青霉素，抗赤霉素，荧光蛋白等，可通过在培养基内加入相应的抗生素来淘汰掉没有发生重组的细菌，或通过其他手段挑取目的菌落（荧光蛋白可在紫光灯下挑取）

⑥ 重组体筛选的常规方法。

根据载体 的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS)，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

⑦ 分子克隆技术包括哪些基本步骤

1、提取DNA基因组或则mRNA（可用试剂盒完成，一般问题都能解决）。
2、设计引物，PCR扩增目的片段。
3、选择合适质粒载体，进行酶连接，构建亚克隆子（有商品化质粒可供选择）。
4、用构建好的质粒转化感受态细胞（方法生物技术实验书中有详细介绍）。
5、筛选阳性克隆。

⑧ 如何筛选和鉴定DNA重组体

通过目的基因的特性来筛选、
比如用青霉素或者其他抗性环境来择选载入成功的重组体、
活下来的就是目的基因表达成功的、

⑨ 插入失活和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么

插入失活是外源目的基因插入到该载体的标记基因上，导致该基因失活，在相应的选择培养基上生长，由于不能表达该蛋白，不能生长从而筛选出重组体。
插入表达筛选是由于外源基因插入到标记基因前的负调控序列，是该序列不能发挥作用，最终标记基因能够表达，从而筛选出重组子。