对酶的活性部位的研究方法

‘壹’ 什么是酶的活性部位，如何用来解释酶的专一性

什么是酶的活性部位，如何用来解释酶的专一性？活性部位指酶分子中直接和底物结合，并和酶的催化作用直接有关的部位。酶的活性中心分为结合部位和催化部位，结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶的专一性。人体依靠大约13,000种不同的酶来思考，感觉，移动，消化（您自己命名），而且涉及这些微观蛋白质中的一种很有可能。这些小蛋白质可以与将近100,000种其他辅酶结合形成有助于人体运转的化学物质。就消化而言，酶是我们赖以生存的关键因素。
没有它们，所有的营养素，包括维生素，矿物质和微量矿物质都无法得到适当利用。虚弱的人容易出现各种健康问题和年龄增长。许多人将患有慢性疾病，例如关节炎，糖尿病，过敏，皮肤病，癌症和免疫缺陷，所有这些都是由低酶水平引起的。

‘贰’ 如何研究酶的活性部位

如何研究酶的活性中心？通过那些实验证明酶活性中心(酶原激活，活性中心的共价修饰)

‘叁’ 酶活性中心的测定方法

测定酶活性中心组成和结构是研究酶催化作用的重要课题。目前常用方法有：化学修饰法、反应动力学法、X－射线衍射法等。
1.化学修饰法：此方法是研究最早，应用最广泛的方法。原则上讲，酶分子侧链上的各种基团，如羧基、羟基、巯基和咪唑基等均可由特定的化学试剂进行共价修饰。当它被某一化学试剂修饰后，若酶活性显着下降或丧失，则可初步推断该基团为酶的必需基团。
2.动力学分析法：酶蛋白是含有许多解离基团的两性电解质，pH改变必然影响到解离基团的解离状态，处于活性中心基团的解离状态的改变必然影响到酶的活性。因此，通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用。另外，改变反应温度求出Vmax和Km与pH关系，从而求出有关基因解离的DH，DH的求得有助于补充pK值对活性中心的判断。在有机溶剂存在条件下，测定酶pK值与介电常数的关系，也有助于对活性部位的判断。
3.X－射线衍射分析法：化学修饰法和动力学分析只能推断酶活性部位氨基酸残基的数目，活性中心空间结构的信息，则需用X－射线衍射法。采用X射线衍射法在研究酶活性中心空间构象时，通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析，从而得到有关酶活性中心构象、酶与底物的接触状况以及催化机理的信息。
4.蛋白质工程：蛋白质工程是近年来发展的研究酶必需基团和活性中心的最先进的方法。蛋白质工程实质是按照人们的设想，通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。利用基因定点突变技术将酶相应的互补DNA（cDNA）基因定点突变，突变的cDNA表达出被一个或几个氨基酸置换的酶蛋白，再测定其活性就可以知道被置换的氨基酸是否为酶活性所必需。此方法可改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基和不引起底物和活性中心结合的立体障碍，以及可人工地造成一个或几个氨基酸的缺失或插入，了解肽链的缩短或延长对酶活性的影响和定点改变酶蛋白的糖基化位点或磷酸化位点，从而了解糖基化或磷酸化对酶结构和功能的影响。

‘肆’ 生物学相关实验中提高酶活性的方法有哪些

调节方法如下：（包括抑制或提高活性）
调节酶的浓度
酶浓度的调节主要有两种方式，一种是诱导或抑制剂的合成；一种是调节酶的降解。
调节酶的活性
激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性。
反馈抑制调节
许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质生成的第一步的酶，往往被它们的终端产物抑制。这种抑制叫反馈抑制(feedback inhibition)。例如由苏氨酸生物合成为异亮氨酸，要经过5步，反应第一步有苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)催化，当终产物异亮氨酸浓度达到足够水平时，该酶就被抑制，异亮氨酸结合到酶的一个调节部位上，通过可逆的别够作用对酶产生抑制。当异亮氨酸的浓度下降到一定程度，苏氨酸脱氨酶又将重新表现活性，从而又重新合成异亮氨酸。
抑制剂可调节
酶受大分子抑制剂或小分子物质抑制，从而影响活性。例如：大分子物质胰蛋白酶抑制剂，可以抑制胰蛋白酶的活性。小分子的抑制剂如一些反应产物：像1，3-二磷酸甘油酸变位酶的活性受到它的产物2，3-二磷酸甘油酸的抑制，从而可对这一反应进行调节。
此外某些无机离子可对一些酶产生抑制，对另外一些酶产生激活，从而对酶活性起调节作用。酶活性也可受到大分子物质的调节，例如抗血友病因子可增强丝氨酸蛋白酶的活性，因此它可明显地促进血液凝固过程。
其他调节方式
通过别够调控、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶活性。

‘伍’ 何谓酶的活性中心，活性中心包括哪些部分

酶的活性中心是酶分子中能够直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位。

第一个是结合部位，酶的底物靠此部位结合到酶分子上；

第二个是催化部位，底物的键在此被打断或形成新的键从而发生一定的化学变化。组成功能部位的是酶分子中在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团。

它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上，而是通过肽链的盘绕、折叠在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构也是功能部位的组成部分。

(5)对酶的活性部位的研究方法扩展阅读

鉴定方法：

1）化学修饰法

观察酶分子被一定的化学试剂修饰前后酶活性的变化情况，结合其它方法，推断该基团是否为活性中心的功能基团。如胰凝蛋白酶与二异丙基氟磷酸（DIFP）作用即会失去活性。DIFP能与酶分子中的Ser残基共价结合，胰凝乳蛋白酶中有28个Ser 残基，而与DIFP作用的仅仅是其中的Ser195。这表明Ser 195是胰凝乳蛋白酶活性中心的组成部分。

2）亲和标记法

是使用一个能与酶的活性中心特异结合的正常底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。该类似物不能为酶所催化而发生化学反应，却能与酶的特定基团发生共价结合使酶失活。

如N-对-甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）是胰凝乳蛋白酶的亲和标记物，当用C14 标记的TPCK与胰凝乳蛋白酶一起保温时，酶即失活。结构分析证明TPCK 与酶分子中的His57发生作用。说明His57是活性中心的另一组成部分。

3）X-射线衍射分析法

可直接观察酶与底物的结合情况。

‘陆’ 酶的活性中心包括哪些部位有何特点有何功能如何研究酶的活性中心通过哪些实验证明酶的活性中心（

您这边有样品的话可以到我们这边检测的

‘柒’ 可以用于判断和确定酶活性的主要方法

可以答研究酶活性部位的方法吗

‘捌’ 酶的活性中心包括哪些部位有何特点有何功能如何研究酶的活性中心

一般认为活性中心主要由两个功能部位组成：第一个是结合部位，酶的底物靠此部位结合到酶分子上；第二个是催化部位，底物的键在此被打断或形成新的键从而发生一定的化学变化。组成功能部位的是酶分子中在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上，而是通过肽链的盘绕、折叠在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构也是功能部位的组成部分。
活性中心必需的基团有：组氨酸的咪唑基、谷氨酸天冬氨酸的侧链羧基和丝氨酸的羟基。

鉴定方法

1）化学修饰法
观察酶分子被一定的化学试剂修饰前后酶活性的变化情况，结合其它方法，推断该基团是否为活性中心的功能基团。如胰凝蛋白酶与二异丙基氟磷酸（DIFP）作用即会失去活性。DIFP能与酶分子中的Ser残基共价结合，胰凝乳蛋白酶中有28个Ser 残基，而与DIFP作用的仅仅是其中的Ser195。这表明Ser 195是胰凝乳蛋白酶活性中心的组成部分。

2）亲和标记法
是使用一个能与酶的活性中心特异结合的正常底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。该类似物不能为酶所催化而发生化学反应，却能与酶的特定基团发生共价结合使酶失活。如N-对-甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）是胰凝乳蛋白酶的亲和标记物，当用C14 标记的TPCK与胰凝乳蛋白酶一起保温时，酶即失活。结构分析证明TPCK 与酶分子中的His57发生作用。说明His57是活性中心的另一组成部分。

3）X-射线衍射分析法
可直接观察酶与底物的结合情况。

‘玖’ 在生物体内存在很多通过改变酶的结构从而调节其活性的方法，请分别举例说明

在生物体内存在很多通过改变酶的结构从而调节其活性的方法，请列举这些方法并分别举例说明。
解答：（1）别构调控：寡聚酶分子与底物或非底物效应物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，从而使酶活性受到调节。例如天冬氨酸转氨甲酰酶的部分催化肽链结合底物后，使酶的整体构象发生改变，提高了其他催化肽链与底物的亲和性，CTP可以与该酶的调节肽链结合，导致酶构象发生改变，降低了催化肽链与底物的亲和性，使酶活力降低，起别构抑制剂的作用。
（2）酶原的激活：在蛋白水解酶的专一作用下，没有活性的酶原通过其一级结构的改变，导致其构象发生改变，形成酶的活性部位，变成有活性的酶，这是一种使酶获得活性的不可逆调节方法。例如在小肠内，无催化活性的胰凝乳蛋白酶原在胰蛋白酶的作用下，特定肽键被断裂，由一条完整的肽链被水解为三段肽链，并发生构象的改变，形成活性部位，产生蛋白水解酶活性。
（3）可逆的共价修饰：由其他的酶（如激酶、磷酸酶等）催化共价调节酶进行共价修饰或去除修饰基团，使其结构发生改变，从而在活性形式和非活性形式之间相互转变，以调节酶的活性。例如糖原磷酸化酶可以两种形式存在，一种是Ser14被磷酸化的、高活力的糖原磷酸化酶a，一种是非磷酸化的、低活力的糖原磷酸化酶b，在磷酸化酶激酶的催化作用下，糖原磷酸化酶b的Ser14被磷酸化，形成高活力的糖原磷酸化酶a；在磷酸化酶磷酸酶的催化作用下，糖原磷酸化酶a的Ser14-PO32-被脱磷酸化，形成低活力的糖原磷酸化酶b。
（4）对寡聚酶活性的调节可以通过改变其四级结构来进行，这种作用既包括使无活性的寡聚体解离，使部分亚基获得催化活性，也包括使无活性的单体聚合形成有催化活性的寡聚体。前者的例子是蛋白激酶A，该酶由2个调节亚基与2个催化亚基组成，是没有酶活性的寡聚酶，胞内信使cAMP与调节亚基结合可导致寡聚酶解离成一个调节亚基复合体和两个催化亚基，此时自由的催化亚基可获得酶活性。后者的例子是表皮生长因子受体，其在细胞膜上通常以无活性的单体存在，当作为信使的表皮生长因子结合到受体的胞外部分之后，两个单体结合形成二聚体，从而使酶被激活。