河南土壤微生物多样性分析方法

㈠ 麻烦有谁知道，做土壤微生物多样性时，用PCR-DGGE方法与RAPD方法间的区别是什么啊急救！

PCR-DGGE主要是扩增微生物的核糖体小亚基基因的可变区，如细菌的16S rDNA的V3区，通过变性梯度凝胶电泳可以将不同序列的DNA片段分离开来，不同位置的条带代表不同的微生物，条带切胶回收测序还可以知道是什么微生物。这种方法不仅可以比较不同土壤样品中微生物群落结构的差别，还可以粗略知道微生物群里结构的组成。
RAPD只能比较不同样品中微生物群落是否有区别，其他就不知道了。
做土壤微生物多样性分析时，现在一般不用RAPD方法了，它得到的信息太少，PCR-DGGE用的也越来越少了。克隆文库获得的信息比较全面，结果主流期刊都认可，但是实验工作量非常大。现在454测序技术很有优势，但是价格还有点儿贵。

㈡ DHPLC能应用于检测土壤微生物的多样性吗

理论上是可以的，但是前处理实在是问题太多，关于前处理现在在国际上都快成分析化学和环境领域的独立分支了。关键是土壤微生物的复杂性以及生物活性的瞬间性，因为一般要分离，而且又要保持它的活性，否则就没有意义了。
DHPLC工作的三种操作模式：非变性模式按片段长度分离，与序列无关，部分变性和完全变性模式均依靠片段大小和序列分离。而且不管单双链还有适用温度范围，DNA片段长度一般都小于2000bp。而土壤微生物本身就达到数十到上百种，所以操作起来很难。

土壤用PCR-DGGE是很成熟的，相反DHPLC看似精度高，但是仪器也娇贵，而且目前世界上用PCR-DGGE
的也不在少数，不知道你是探索新的方法还是没有搞过土壤微生物，想研究一下，我觉得把PCR-DGGE用好就相当厉害了，主要是这种方法更普遍，更具有公信力。

㈢ 怎么分析微生物群落结构和多样性

微生物群落的种群多样性一直是微生物生态学和环境学科研究的重点。近几年来，微生物群落结构成为研究的热点。首先，群落结构决定了生态功能的特性和强弱。其次，群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。再次，群落结构变化是标记环境变化的重要方面。因此，通过对目标环境微生物群落的种群结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。
从年代上来看，微生物群落结构和多样性解析技术的发展可以分为三个阶段。20世纪70年代以前主要依赖传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，对环境微生物群落结构及多样性的认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人员通过对微生物化学成分的分析总结出了一些规律性的结论，从而建立了一些微生物分类和定量的方法即生物标记物方法，对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代，现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。
1 传统培养分离方法
传统培养分离方法是最早的认识微生物群落结构和多样性的方法，自1880年发明以来一直到
现在仍被广泛使用。传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少(仅占环境微生物总数的0.1%～10%[1])。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测种群结构的动态变化。
2 群落水平生理学指纹方法(CLPP)
通常认为微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。酶分子对于所催化的生化反应特异性很高，不同的酶参与不同的生化反应。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一，标记了某种群的存在。由Garlan和Mills[2]于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)是通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性分析方法。具体而言，CLPP分析方法就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源基质的利用能力，来确定那些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。由BIOLOG公司开发的BIOLOG氧化还原技术，使得CLPP方法快速方便。商业供应的BIOLOG微平板分两种：GN和MT，二者都含有96个微井，每一
128 生态环境 第14卷第1期（2005年1月）

微井平板的干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑[3]。其中，BIOLOG的GN微平板含有95种不同碳源和一个无碳源的对照井，而MT微平板只含有培养基和氧化还原染料，允许自由地检测不同的碳源基质[3]。检测的方法是：将处理的微生物样品加入每一个微井中，在一定的温度下温育一定的时间(一般为12 h)，在温育过程中，氧化还原染料被呼吸路径产生的NADH还原，颜色变化的速率取决于呼吸速率，最终检测一定波长下的吸光率进行能源碳的利用种类及其利用程度的分析[4]。
BIOLOG方法能够有效地评价土壤和其它环境区系的微生物群落结构[3~6]。其优点是操作相对简单快速，而且少数碳源即能区别碳素利用模式的差别[5]。然而，BIOLOG体系仅能鉴定快速生长的微生物，而且，测试盘内近中性的缓冲体系、高浓度的碳源及有生物毒性的指示剂红四氮唑(TTC)使得测试结果的误差进一步增大。姚槐应[5]的研究表明，应根据测试对象的特点（例如pH，碳源利用类型及利用能力）改进BIOLOG体系，并且，有必要研究更好的指示剂来取代TTC。
3 生物标记物方法
生物标记物(Biomakers)通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。由于特定结构的标记物标志着特定类型的微生物，因此一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。由于分类的依据是从混合微生物群落中提取的生化组成成分，潜在地包括所有的物种，因而具有一定的客观性。并且分析简便快速，适于定性甚至半定量地检测微生物体系的动态变化。20世纪80年代以来常用于研究微生物群落结构的生物标记物方法包括：醌指纹法(Quinones Profiling)、脂肪酸谱图法(PLFAs和WCFA-FAMEs)。测定时，首先使用合适的提取剂提取环境微生物样品中的这些化合物并加以纯化，然后用合适的溶剂制成合适的样品用GC或LC检测，最后用统计方法对得到的生物标记物谱图进行定性定量分析。
3.1 醌指纹法(Quinones Profiling)
呼吸醌广泛存在于微生物的细胞膜中，是细胞膜的组成成分，在电子传递链中起重要作用[7]。醌的含量与土壤和活性污泥的生物量呈良好的线性关系的研究表明，醌含量可用作微生物量的标记[8]。有两类主要的呼吸醌：泛醌(ubiquinone, UQ)即辅酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即维生素K[9]。醌可以按分子结构在类(UQ和MK)的基础上依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的
氢原子数进一步区分。研究表明，每一种微生物都含有一种占优势的醌[7]，而且，不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌[9]。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。
用醌指纹法描述微生物群落的参数[7]有：(1)醌的类型和不同类型的醌的数目；(2)占优势的醌及其摩尔分数含量；(3)总的泛醌和总的甲基萘醌的摩尔分数之比；(4)醌的多样性和均匀性；(5)醌的总量等。对两个不同的群落，由上述分析所得数据可以计算出另一个参数____非相似性指数(D)，用于定量比较两个群落结构的差异。
醌指纹法具有简单快速的特点，近几年来广泛用于各种环境微生物样品(如土壤，活性污泥和其它水生环境群落)的分析。
考察了醌指纹法分析活性污泥群落的分析精度，证明此方法是一种可靠的分析方法。然而，醌指纹法也存在一定的局限性，它不能反映具体哪个属或哪个种的变化。 3.2 脂肪酸谱图法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)
从微生物细胞提取的脂肪类生化组分是重要的生物量标记物，例如，极脂(磷脂)、中性脂类(甘油二酯)可分别作为活性和非活性生物量的标记物[10]。更重要的是，提取脂类的分解产物____具有不同分子结构的混合的长链脂肪酸，隐含了微生物的类型信息，其组成模式可作为种群组成的标记。多种脂肪酸谱图法广泛用于土壤、堆肥和水环境微生物群落结构的分型和动态监测[11~13]。
常用的脂肪酸谱图法可分为两种：磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法和全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法[14]。二者分析的对象实质上都是脂肪酸甲酯，不同之处在于提取脂肪酸的来源不同。磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法提取的脂肪酸主要来源于微生物细胞膜磷脂即来源于活细胞，全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法提取的脂肪酸来源于环境微生物样品中的所有可甲基化的脂类即来源于所有的细胞（包括活细胞和死细胞）。因此，磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法的优点在于准确，可靠；全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法的优点在于提取简捷，所需样品量少。对多个环境微生物样品分析而言，先用WCFA-FAMEs谱图法预先筛选再用PLFAs法进行分析是提高效率的较佳选择。
脂肪酸谱图分析包括两种形式：一种是脂肪酸，采用GC分析仪达到分离不同结构的分子的目的；另一种是脂肪酸甲基化产物____脂肪酸甲酯，采用GC-MS分析仪进行不同分子的分离和鉴定。

㈣ 如何调查土壤中微生物种类

真菌类

存在种类庞大且多样。人类仅了解当中极少部分真菌类的作用，其他的几乎不清楚。

放线菌类

具有分解霉菌等有机物的能力。多半属于制造抗生物质的菌类，有抑制病原菌的作用。

丝状真菌类

也就是种类超过10万种的霉菌。已知极少部分的丝状真菌是导致蔬菜生病的病原菌。

藻类

除了水中之外，有许多种藻类也存在在土壤中。有些藻类会吸收空气中的氮。

蚯蚓

蚯蚓能吃下含有腐殖质的土壤然后排泄出来，是耕土促使土壤团粒化的帮手。

蜱螨类

小于1MM的土壤动物。土壤列存在许多会捕食、会寄生的蜱螨类。

原虫类

移动捕食并且分解有机物的单细胞原生动物，，草履虫、眼虫藻等的伙伴。

线虫类

小于数毫米的微小土壤动物。种类很多，寄生在蔬菜根的仅仅是很少一部分。

甲螨

0.2~1.5mm的小型草食性土壤动物，也是土壤里最多的土壤动物。通过分解落叶为生。

跳虫类

小于数毫米的土壤动物，分解霉菌、藻类为生。被称为“大地的浮游生物”，是物质循环的重要角色。

㈤ 土壤微生物多样性韦恩图怎么分析小木虫

如果想做多样性的话 就用二代测序吧 根据结果可以做多样性分析 如果想要提纯菌种 那就要好好选培养基了 99%的土壤细菌是不可培养的 一般来说PDA足够了 细菌真菌都可以长 如果想要真菌的话在PDA中加2%土霉素

㈥ 土壤生物多样性分析方法

可以讲土壤放在蒸馏水中，搅拌，制成土壤浸出液，（会含有各种土壤中营养成分和细菌等），然后配置各种培养基（选择培养基或鉴别培养基）都可，之后将各种培养基上进行土壤浸出液的涂布，最后进行培养，就可以知道，次土壤样本中微生物的分布状况。

㈦ 土壤微生物多样性用传统的方法怎样鉴定和分类

用不同的培养基进行培养，然后再根据不同形态继续分离，就可以得到不同微生物的纯菌株。
呵呵我觉得是

㈧ 土壤微生物的土壤微生物多样性

土壤微生物功能多样性：指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度，主要从分类学、系统学和生物地理学角度对一定地域内物种的现状进行研究。目前主要通过培养基最大限度地培养各种菌落，由此了解土壤中可培养的微生物种群。
土壤微生物的功能多样性：指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行过程，对自然界元素循环具有重要意义如：分解功能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的功能等。
目前一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微生物群落的代谢功能多样性。
土壤微生物结构多样性：指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因。
土壤微生物的遗传多样性：是土壤微生物在基因水平上携带的各类遗传物质和遗传信息的总和，这是微生物多样性的本质和最终反映。

㈨ 采用什么方法，可以从鉴定土壤中的微生物群落组成.确定优势菌株

鉴定土壤中的微生物群落组成.确定优势菌株
微生物群落的种群多样性一直是微生物生态学和环境学科研究的重点。近几年来，微生物群落结构成为研究的热点。首先，群落结构决定了生态功能的特性和强弱。其次，群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。再次，群落结构变化是标记环境变化的重要方面。因此，通过对目标环境微生物群落的种群结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。
从年代上来看，微生物群落结构和多样性解析技术的发展可以分为三个阶段。20世纪70年代以前主要依赖传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，对环境微生物群落结构及多样性的认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人员通过对微生物化学成分的分析总结出了一些规律性的结论，从而建立了一些微生物分类和定量的方法即生物标记物方法，对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代，现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。

㈩ 高通量测序中如何判断土壤微生物数量的多少

在陆地生态系统中，在土壤中生活有数量庞大的微生物种群，包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物, 以及真核生物如真菌、藻类( 蓝藻除外) 、地衣等。它们与植物和动物有着明确的分工，主要扮演“分解者”的角色，几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应，担负着地球C、N、P、S 等物质循环的“调节器”[1 ]、土壤养分植物有效性的“转化器”和污染环境的“净化器”等多方面生态功能[2 ]。土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因) 多样性、生态特征多样性和功能多样性[3 ]。由于土壤微生物的复杂性、土壤本身的多变性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人们对土壤微生物多样性的研究与动、植物相比远远落后。随着多聚酶链反应(PCR)、核酸测序等现代生物学分子生物学技术的迅速发展, 人们对土壤微生物多样性有了更多的了解；高通量测序技术的发展则为研究土壤宏基因组提供了大量数据，为直接探究土壤中的微生物群落结构提供了客观而全面的信息。
一、对土壤微生物进行研究的方法
1、微生物平板培养法
传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。
这种方法只限于极少量（0.1%-1%）可以培养的微生物类群，无法对绝大多数微生物的分类地位和系统发育关系的深入研究。
2、分子生物学技术结合测序的方法
在过去的20多年里，分子生物学技术，尤其16SrDNA技术已经广泛应用于鉴定未知菌的研究中。20世纪80年代以来, 逐步建立起了以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸图谱分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、稳定同位素探针( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。
其中运用比较广泛并被普遍认可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，检测的DNA片段长度范围以200bp ～900bp为佳，超出此范围的片段难以检测[4]，PCR 扩增所需G/C 碱基对含量至少达40 % ，通常只能检测到环境中优势菌群的存在，只有占整个群落细菌数量约1％或以上的类群能够通过DGGE检测到[5]。TGGE 仪器所允许的温度范围为15 ℃～80 ℃，较大片段DNA 的Tm 值因为接近80 ℃而使检测难度提高；若电泳条件不适宜，不能完全保证将有序列差异的DNA片段分开，从而出现序列不同的DNA 迁移在同一位置的现象。
3、高通量测序方法
近年来，16S rRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600碱基的序列，足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[8]，因此454高通量测序的方法因其读长（400~500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不论是全长还是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析(phylogenetic analysis)。
高通量测序的优越性体现在：测序序列长，可以覆盖16S /18S rDNA、ITS等高变区域； 测序通量高，可以检测到环境样品中的痕量微生物；实验操作简单、结果稳定，可重复性强；无需进行复杂的文库构建，微生物DNA扩增产物可以直接进行测序，实验周期短；测序数据便于进行生物信息分析。
该方法得到顶级期刊的认可（Nature等），已成为土壤微生物多样性检测的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，为客户提供的土壤样本进行高通量测序并进行生物信息学分析。高通量测序因其数据量大，操作过程简单，尽可能避免了繁琐的实验操作过程所造成的样本损失，能够相对客观的反应出土壤样本的真实情况。
二、高通量测序在土壤微生物研究中的应用
1、 研究土壤微生物的物种多样性
微生物物种多样性主要从对微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成来描述微生物多样性，或者按照微生物在生态系统中的作用将其划分成不同的功能群(function group)，通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土壤微生物多样性，如对土壤中的产甲烷细菌、固氮菌、根瘤菌等的多样性进行研究。以下是几篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454测序法对西半球的一个大的横断面的4类土壤进行检测和统计学评价。结果表明，这4种土壤中，最丰富的微生物类群拟杆菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲。与农业土壤相比，森林土壤的微生物多样性更为丰富，然而检测结果表明森林土壤中的古生菌多样性较少，仅为该位点所有序列的0.009%，而农业土壤的比例则为4% -12%。
土壤中细菌的多样性差距非常大，因土壤结构的不同土壤中的细菌群体也呈现出多样化。Triplett等[10]基于焦磷酸测序法来对16S rRNA的V2-V3区域进行测序，估测9个草地土壤中的菌群的整体和垂直特性。对所有752,838条数据序列进行聚类分析，探索菌群在丰度、多样性和组成成分等方面的特异性。作者发现在不同的土壤层中，细菌系统发生的种群或者亚群的不同分配是与土壤的性质有关的，包括有机碳含量、总含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多样性
土壤微生物功能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与N、P、S 等营养元素在土壤中转化相关的功能等, 通过分析测定土壤中的一些转化过程, 如有机碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等来了解土壤微生物功能。
氨氧化反应是硝化作用的第一步，也是全球氮循环中由微生物活动形成硝化盐的重要进程。Leininger[11]检测了3个气候区域12块原始和农业用地的土壤里编码氨单加氧酶(amoA)的一个亚基的基因丰度。采用反向转录定量PCR研究及无需克隆的焦磷酸测序技术对互补DNA测序，证实古细菌的氨氧化活性要远高于细菌，证实Crenarchaeota可能是土壤生态系统中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的环境转录组学方法同时获得土壤微生物种群结构和功能信息。结果认为，通过该方法可以同时研究微生物生种群结构与功能从而避免其他方法所造成的偏差。群落基因组学分析可以通过研究微生物基因组序列与某些表达特征之间的关系，获得一些微生物功能方面的信息。但同时也需要运用其他方法将特定功能与具有这种特定功能的微生物群落结构对应起来。对rRNA表达基因和与环境因素相关的主要酶类的基因进行定量化和比较分析，将能了解微生物结构与特定功能之间的关系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是参与到氮流失和温室气体排放等氮循环过程的重要流程之一。通过宏基因组测序的方法，结合分子检测和焦磷酸测序，Ryan等分离鉴定了操纵编码反硝化过程的酶类。通过筛选77,000个土壤宏基因组文库中得到的克隆，最终分离并鉴定了9个参与反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响
环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。Zachary等[14]以重水稳定同位素探测技术（H218O-SIP）鉴定与土壤增湿相关的细菌。通过液相色谱/质谱（LC-MS），作者确定H218O中的氧原子结合到了所有的DNA结构成分中。尽管这种结合不是均匀的，还是可以明显的将标记了18O和未标记的DNA区分开来。作者发现DNA和细胞外的H2O中的氧原子在体外没有发生交换，表明掺入DNA的18O是相对稳定的，并且掺入到细菌DNA中的18O的比例较高（48-72h）。土壤增湿后，对土壤中16S rRNA进行高通量测序，发现Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究和生态类群的划分。