蛋白质定量分析方法

㈠ 常用的血清蛋白质含量测定方法有哪些

四种血清总蛋白质的测定的方法：

1.基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚试剂比色法 由于各种蛋白质分子中上述两种氨基酸的组成比例不同，特别是白蛋白含色氨酸为0.2%，而γ-球蛋白中含量达2%-3%，导致较大的差异。Lowry的改良法在酚试剂中加入Cu2+，集中原法和双缩脲反应两者的作用，使呈色灵敏度提高。其中75%的呈色依赖于Cu2+.反应产物最佳吸收峰在650-750nm，方法灵敏度为双缩脲方法的100倍左右。有利于检测较微量的蛋白质。但试剂反应仍易受多种化合物的干扰。

2.紫外测定法 采用280nm和215/225紫外吸收值，计算蛋白质含量280nm 是由于蛋白质分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特异性和准确性受蛋白分子中该种氨基酸的含量比例影响甚大。尿酸和肝红素在280nm附近有干扰。紫外区200-225nm是肽健的强吸收峰。在此区域其吸收值为280nm的10-30倍，将血清稀释1000-2000倍可以消除干扰物质的影响。

3.采用沉淀反应进行散射比浊法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚为简便，不需特殊仪器，技术关键在于：①选择最佳试剂浓度及温度；②混匀技术；③选用的标准；④待测标本中的蛋白浓度。

4.染料结合法 蛋白质可与某些染料特异结合，如氨基黑（amino black）与考马亮蓝（comassive brilliant blue ）。这一性质除了可以用于电泳后的蛋白质区带染色，亦可用于总蛋白质的定量。缺点是多种蛋白质与染料的结合力不一致。考马亮蓝在与蛋白质结合后的吸收峰从465nm移向595nm，这一性质可用分光光度法来定量检测。

㈡ 蛋白质的定量分析和氨基酸的定量分析的区别

二者原理不同。
1， 紫外吸收：色，酪，苯丙等芳香族氨基酸所含的环状结构在280nm波长附近具有最大光吸收峰，而大多数蛋白质含有这些氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液在紫外区280nm的光吸收值，可以定量测定溶液蛋白质含量，是一种简便快捷的方法。
2。茚三酮：氨基酸与茚三酮的水合物共同加热，可生成蓝紫色化合物，在570nm处有最大吸收峰。其颜色的深浅与氨基酸的氨量成正比，是氨基酸的定量分析方法。

㈢ 目前蛋白质的精确定量检测方法都有哪些

蛋白质鉴定是指对复配类蛋白品通过前处理提纯并通过生物质谱鉴定蛋白种类及含量（包括具体的分子量、定性、定量结果）或对纯蛋白品通过生物质谱鉴定具体的蛋白类型（包括具体的分子量、定性、定量结果）。
蛋白质种类鉴定业务范围：

水溶性蛋白、水解酶、蛋白酶、脂肪酶； 血清蛋白（白蛋白和球蛋白）、牛血清（白）蛋白、血清球蛋白； 乳清蛋白、复合蛋白质、乳清蛋白粉、β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，免疫球蛋白，乳铁蛋白； 大豆分离蛋白、小麦蛋白（谷朊粉）、酪蛋白、纤维素酶、β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、糖化酶； 碱性蛋白酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸水解酶、脂肪酶、过氧化氢酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶、弹性蛋白酶。 动物饲料，大米，油料种子、谷类食品、谷类，大豆、玉米、鱼肉、果汁等各种食物中蛋白种类及含量。

㈣ 常用的蛋白质含量测定方法有哪些

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

㈤ 蛋白质的定量检测方法有哪些

楼上的方法只能测定总蛋白量，要绝对测定某一种蛋白，必须要用Elisa或者放射性免疫等方法，用抗体；半定量的话可以用Western
blot。

㈥ 测定蛋白质的定量的方法有哪些及其原理各是什么

常用的蛋白质纯化方法有离子交换色谱、亲和色谱、电泳、疏水色谱等等
离子交换色谱：蛋白质和氨基酸一样会两性解离，所带电荷决定于溶液ph。ph小于pi时蛋白质带正电，ph大于pi时蛋白质带负电。不同蛋白质等电点的蛋白质在同一个溶液中，表面电荷情况不同。离子交换就是利用不同蛋白质在同一溶液中表面电荷的差异来实现分离的。
亲和色谱：生物大分子有一个特性，某些分子或基因对它们有特异性很强的吸附作用。如镍柱中ni可以与his标签的蛋白结合，这种只针对一种或一类物质的吸附就是亲和色谱的原理。
电泳：sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，sds能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的sds溶液中，
与sds分子按比例结合，形成带负电荷的sds-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的sds，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于sds与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
疏水色谱：疏水色谱基于蛋白质表面的疏水区与介质疏水配体间的相互作用，在高浓度盐作用下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏被释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附。疏水色谱就是利用样品中各组分在色谱填料上配基相互作用的差异，在洗脱时各组分移动速度不同而达到分离的目的。随着盐离子浓度的降低，疏水作用降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质被解吸附。

㈦ 蛋白质含量测定药典规定必须用什么方法

使用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。
凯氏定氮法 凯氏定氮法

蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍

【GB/T 5009.5—1985】
食品中蛋白质的测定方法

本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。
1 原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。
3 仪器
定氮蒸馏装置：如图所示。
（图略）
4 操作方法
4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作。
4.4 计算

式中：X——样品中蛋白质的含量，%；
V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m——样品的质量(体积)，g(ml)；
F——氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
附加说明：
本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。
本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

㈧ 几种蛋白质含量测定方法的比较研究

摘要:目的:为培养的肝细胞及神经元蛋白质含量测定选择最佳方案。方法:采用三种较为常用的蛋白质含量测定方法:Bradford、Lowry和Bio-rad
DC法分别对培养的小鼠肝细胞、神经元细胞的全细胞蛋白质提取样品进行测定。并对结果进行比较。结果:蛋白质含量测定及重复性实验对比分析可见，用Bradford、Lowry和Bio-rad
DC法测定肝细胞蛋白质样品.结果均较稳定;测定神经元蛋白质样品，Bradford和Bic-rad
DC法较稳定，Lowry法不稳定。

㈨ 常用来测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点是什么

1、凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

优点：可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

优点：测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

3、酚试剂法

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。

缺点：①费时，要精确控制操作时间；②酚法试剂的配制比较繁琐。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 

缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

5、考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。

在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。

缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。