什么方法可以检测植物细胞自噬

A. 通过什么技术可以验证植物细胞具有全能性

植物细胞全能性原因是植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息,从而具备发育成完整植株的遗传能力.在适宜条件下,任何一个细胞都可以发育成一个新个体.植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础.

B. 检测自噬的方法有哪些

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
（一）自噬诱导剂
1）bredeldin
a
/
thapsigargin
/
tunicamycin
：模拟内质网应激
2）carbamazepine/
l-690，330/
lithium
chloride（氯化锂）：impase
抑制剂（即inositol
monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）n-acetyl-d-sphingosine（c2-ceramide）：class
i
pi3k
pathway抑制剂
5）rapamycin：mtor抑制剂
(最常用)
6）xestospongin
b/c：ip3r阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-methyladenine（3-ma）：（class
iii
pi3k）
hvps34
抑制剂
2）bafilomycin
a1：质子泵抑制剂
3）hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义rna干扰技术（knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
（三）自噬检测方法：
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1）western
blot检测lc3的切割
利用western
blot检测lc3-ii/i比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型lc3会酶解掉一小段多肽形成lc3-i，lc3-i跟pe结合转变为（自噬体）膜型（即lc3-ii），因此，lc3-ii/i比值的大小可估计自噬水平的高低。
2）在荧光显微镜下采用gfp-lc3单荧光体系/mrfp-gfp-lc3双荧光体系等融合蛋白来示踪自噬形成：
gfp-lc3
单荧光自噬指示体系：
利用lc3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出gfp-lc3指示技术：无自噬时，gfp-lc3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western
blot
检测游离的gfp、p62来验证。
另一种方法是利用mrfp-gfp-lc3
。
mrfp-gfp-lc3
双荧光自噬指示体系：
由于分子生物学的发展，现在已经诞生了mrfp-gfp-lc3
双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪lc3以及自噬流的变化。其中gfp是酸敏感型gfp蛋白，而mrfp是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致ph下降，gfp淬灭，因此，gfp的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，gfp越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mrfp是一直稳定表达的，因而可以通过gfp与mrfp的亮点比例来评价自噬流进程。
mrfp-gfp-lc3
双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。
3）透射电镜下观察自噬体的形成：
自噬经历了：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)
透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。

C. 哪些因素可以诱导细胞自噬的发生

很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等。
细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。

D. 什么方法可鉴别细胞死活

如果是植物细胞的话可以用质壁分离的方法。如果是动物细胞的话可以观察它与外界是否有物质交换。

E. 什么是细胞自噬

自噬是指细胞分解细胞质等自身构成成分的现象。自噬作用是细胞加速新陈代谢，或者在饥饿时获得能量的一个重要手段。自噬在各种生命活动中发挥着重要作用，比如它可以加速细胞内的新陈代谢，或者在细胞处于饥饿状态时从分解产物中获得能量。自噬过程中，细胞需要一个特殊的“口袋”将有待分解的物质包围并隔离起来，这个叫做自噬体的“口袋”由双层脂质膜构成，但它的形成机制一直是个谜。日本科学家最近研究发现，原来是一种名为“Atg8”的蛋白质在自噬体形成过程中发挥着作用。研究人员发现，“Atg8”和一种磷脂分子结合后，就可以黏合脂质膜，进而形成自噬体。在使用酵母进行的实验中，如果彻底破坏“Atg8”的功能，酵母细胞内就不能形成自噬体，而如果“Atg8”的部分功能受损，酵母细胞形成的自噬体明显比正常细胞的自噬体小。

F. 植物细胞膜透性的测定方法有哪些

1、可以用电导法，电导法的原理就是细胞内外电位变化。
2、可以用植物细胞的质壁分离法，动物细胞可以用细胞失水发，以及主动运输时营养物质运输原理法。

植物细胞是植物生命活动的结构与功能的基本单位，由原生质体和细胞壁两部分组成。原生质体是细胞壁内一切物质的总称，主要由细胞质和细胞核组成，在细胞质或细胞核中还有若干不同的细胞器，此外还有细胞液和后含物等。植物细胞一般很小，高等植物中，其直径通常为10-100μm。植物细胞的形态多种多样，常见的有圆形、椭圆形、多面体、圆柱状和纺锤状。它们的基本结构是由原生质体和细胞壁组成。

G. 如何用简单的方法判断植物细胞的死活

将细胞放到染色剂中，观察细胞是否被染色。如果被染色了，则说明该细胞已经死亡。因为细胞膜控制物质进出细胞，而像染色剂，对细胞有害，正常情况下进不入细胞中。呵呵，希望对你有所帮助！

H. 怎样才能更清晰的看到植物细胞的液泡 用什么方法

1.可观察洋葱表皮细胞
2.可用红墨水染色
3.可让视野变暗，用平面镜、小光圈
4.可用相差显微镜

I. 除了改良苯酚品红染色,还有哪些染色方法可以检测植物细胞程序性死亡,其原理是

用台盼蓝染色，死细胞会被染成蓝色，而活细胞不着色，从而判断细胞死活

死细胞的鉴别一般通过DNA结合染料排除，利用死细胞膜通透性增大、不破膜的情况下DNA染料即可进入的特点区分出死细胞，但所用染料浓度、时间远远低于细胞周期所用的浓度，并且不需要固定。

常用的核酸结合死活鉴别染料包括：

碘化丙啶（propidium iodide，PI）

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）

7-氨基 - 放线菌素D（7-amino-actinomycin D ，7-AAD）

DRAQ7

SYTOX

不过对于一些胞内抗原（细胞因子、转录因子），由于需要固定、破膜，所以上述染料中，除了一些胺类染料（如Live/Dead、Ghost等）和新型蒽醌类染料CyTRAK Orange外，其它染料不再适合此类标本的细胞死活鉴别。

这里，只向大家讲解一下用PI、7-AAD、DAPI的染色方法，其它商品化死活染料请按照说明书操作：

1. 用0.5ml 1×PBS重悬细胞。

2. 加入PI或DAPI或7-AAD，终浓度分别为PI（5 µg/ml）、DAPI（500-1000 ng/ml）、7-AAD（2.5 µM）

3. 加入上述染料后，尽快上机，一般不要超过5分钟（有些厂家说明书写着10分钟，可能与浓度有关，可按照说明书操作）。

PI检测通道：使用488 nm激发，用610/20 BP收集

DAPI检测通道：最好用355nm激发，用440/40BP收集；也可以用405nm激发，450/50BP收集

7-AAD检测通道：用488nm激发，用670/14BP收集

下图是用PI检测细胞死活的结果图：

1、细胞死亡：细胞死亡作为生物体的一种常见现象，在动物细胞中有三种方式：凋亡（apoptosis），自噬（autophagy）和坏死（necrosis）。前两种类型属于细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）。细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡，以细胞质膜的破裂为特征，造成内含物的炎性泄露，是一种非正常死亡。细胞的PCD是细胞的一种“主动性”死亡行为，从形态上和功能上都与细胞坏死有很大的不同。

2、植物中细胞程序性死亡（PCD）：目前可依据液泡膜破裂后，是否在细胞质中发生快速降解将PCD分为两个大类。第一类为自溶性（autolytic）PCD，与液泡中的水解酶的释放有关，在液泡破裂后，导致细胞质的快速清除。第二种为非自溶PCD，（non-autolytic），即液泡膜破裂但是没有出现快速的细胞质的清除。目前鉴定细胞的PCD类型，还是以细胞形态学为主。

3、动植物细胞凋亡标准：动物：凋亡：凋亡小体，或者在细胞表面的水泡，感染病原体后在其他细胞中的降解。自噬：自噬小体，自溶酶体，和小的促进细胞溶解的液泡数目的增加坏死：没有上面的定义的标准。植物：自溶：植物膜破裂之后对细胞质的快速清理。非自溶：没有对细胞质的快速清理。其他：染色质浓缩细胞核破裂自我标记信号自食信号细胞膨胀，细胞器膨胀，质膜破裂染色质浓缩。液泡体积增加（细胞质体积减小）需要Ca2+的内流，细胞质皱缩，细胞器膨胀，小泡增多但体积不增加。