hplc分析方法

Ⅰ 什么叫HPLC分析法

这个是属于色谱的入门基础问题，建议你上“色谱世界”网站看看，这个网站在色谱方面很专业，高手非常多，估计对你会很有帮助的。

Ⅱ HPLC原理及基本操作是什么

原理

高效液相色谱法仪根据各种各样的相互作用力来分离混合物。这种相互作用力通常是分析物及分析管柱之间的一种非共价性质。

使用高效液相色谱时，液体待检测物在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物中不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，每个峰顶都代表一个另外化合物的种类，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。

以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪。采用高压输液泵，高效固定相和高压灵敏检测器等装置的液相色谱仪成为高效液相色谱仪。高效液相色谱仪种类繁多，但不论何种类型的高效液相色谱仪，基本上都分为4个部分：高压输液装置，进样系统，分离系统和检测系统。

操作

将要分离和分析的样品混合物以不连续的小体积（通常为微升）引入渗透通过色谱柱的流动相流中。样品的组分以不同的速度通过色谱柱，这是与吸附剂（也称为固定相）的特定物理相互作用的函数。每个组分的速度取决于其化学性质，固定相（柱）的性质以及流动相的组成。

特定分析物洗脱（从色谱柱中出现）的时间称为其保留时间。在特定条件下测得的保留时间是给定分析物的识别特征。

可以使用许多不同类型的色谱柱，其中填充了粒径，孔隙率和表面化学性质各异的吸附剂。使用较小的颗粒尺寸的包装材料需要使用较高的操作压力（“背压”）的和通常改善的色谱分辨率（连续的分析物从柱中出现的峰之间的分离度）。吸收剂颗粒本质上可以是疏水的或极性的。

常用的流动相包括水与各种有机溶剂的任何混溶性组合（最常见的是乙腈和甲醇）。一些HPLC技术使用无水流动相（请参见下面的正相色谱法）。

流动相的水性成分可能包含酸（例如甲酸，磷酸或三氟乙酸）或盐以帮助分离样品成分。在色谱分析过程中，流动相的组成可以保持恒定（“等度洗脱模式”）或变化（“梯度洗脱模式”）。等度洗脱通常在分离与固定相亲和力非常不同的样品成分时非常有效。

在梯度洗脱中，流动相的组成通常从低到高洗脱强度变化。流动相的洗脱强度由分析物的保留时间反映，高洗脱强度可产生快速洗脱（=较短的保留时间）。

反相色谱中的典型梯度曲线可能始于5％的乙腈（在水或水性缓冲液中），然后在5–25分钟内线性增长至95％的乙腈。恒定流动相组成的周期可以是任何梯度曲线的一部分。例如，流动相的组成可以在5％的乙腈中保持1-3分钟，然后线性变化直至95％的乙腈。

流动相的选定组成取决于各种样品组分（“分析物”）和固定相之间的相互作用强度（例如，反相HPLC中的疏水相互作用）。根据它们对固定相和流动相的亲和力，在色谱柱中进行分离过程中，分析物会在两者之间分配。

此分配过程类似于液-液萃取过程中发生的分配过程，但该过程是连续的，而不是逐步进行的。在此示例中，使用水/乙腈梯度洗脱，一旦流动相在乙腈中的浓度更高（即，在洗脱强度更高的流动相中），则更多的疏水性组分将较晚洗脱（从色谱柱中洗脱）。

流动相组分，添加剂（例如盐或酸）和梯度条件的选择取决于色谱柱和样品组分的性质。通常对样品进行一系列的试验，以便找到可以充分分离的HPLC方法。

用途

高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中，常用于医药品、化学、环保、生命科学、与食品工业的研究上。

高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成分分离、成分定性及定量分析。适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。例如：可检测分析食品中的三聚氰胺的含量。

Ⅲ 如何分析高效液相色谱图

分析色谱图的方法：

手动进样步骤 配置好流动相，将滤嘴洗头放入流动相页面内，打开泵和检测器，快跑排除气泡，设置既定流速，稳定一段时间，让基线跑平，用液相针吸取称量融配脱气后的对照（含量已标定）。

打开定量环将液相针里的液体匀速注入定量环中，拔出针头好立刻关闭六通阀，一般随六通阀关闭电脑自动采样，等主峰跑完整后记录其峰面积，一般跑两个对照，每个对照跑两针，共四针。

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显着地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

Ⅳ 高效液相色谱法有哪些特点

1、高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

2、高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，小于1小时。

3、高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

4、高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

5、应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

6、柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

7、样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

高效液相色谱分析的流程

由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。

遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，

而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

以上内容参考：网络-高效液相色谱、网络-高效液相色谱分析法

Ⅳ 个液相色谱分析方法的步骤有哪些

考察方法：当物质达到定量限浓度以上时：在线性范围内：通过回收率试验来确定：测得结果与实际量间是否一致：信号噪音=10：查看方法多次测定是否能够得到相同的结果。考察方法，方法仍然能够保持测定的准确，包括流动相、辅料空白含量方法学认证主要考察以下几个性质:1时： 1专属性：当被测物峰高，方法精密度（多次测定同一样品查看结果。考察方法，测定同一样品，测得峰面积与被测物质的量是否能够呈线性关系：查看被测物质与被测结果间是否正确且唯一对应：重复性试验：将处被测成分外的其他物质均做空白干扰对照：方法对实验环境的耐受程度，最好试剂和实验室也更换，当前浓度即为定量限，计算回收率和结果偏差，中间精密度（不同人员不同时间不同仪器、色谱柱批次、溶剂空白、其他成分（多组分产品）空白.9999以上才能算呈线性、流速。即当实验条件发生细微变化时，即配制多个供试品溶液），绘制标准曲线，该方法可以对该物质进行定量检测，色谱条件变化（应包括柱温。考察方法，测定时应采取对照品（或原料）加辅料等其他干扰，应包括仪器精密度（对照多次进样查看偏差）。RSD应小于2% 3准确度：线性试验、检测波长等条件的轻微变化），应包含3个浓度至少9个样品的测定结果。 6耐用性、如果方法有衍生还应包括衍生空白等等。 2精密度。如果想做更加可靠的实验，查看结果偏差）。 5定量限，应取至少5个浓度点。考察方法，液相色谱法中一般认为R=0：溶液稳定性（相同溶液在几小时内多次进样查看结果），RSD小于2% 4线性。视方法而定一般回收率应在95~105%。考察方法：通过几项实验来确定，计算线性相关系数，应在定量限处考察精密度和回收率，该测定应包含全部试验过程

Ⅵ 简述HPLC-UV,HPLC-Ms,HPLC-DAD的各分析方法

都有高效液相系统,后面的连用不一样：UV指紫外检测器,可以是固定波长的,也可以是全波长（DAD）的.Ms指质谱.DAD指全波长扫描紫外检测.

Ⅶ 高效液相色谱怎么分析

计算含量的方法很多：
面积归一化法，外标法，内标法
常用的：
面积归一化法那很简单，配制一个供试品，进样分析。一个色谱峰代表一个物质，最大的那个通常是你的主峰，其余的基本都是杂质。
杂质（%）=杂质的峰面积/主峰峰面积*100%（这个数值在你的分析报告中应该可以看到）

如果是外标法或者内标法，你需要有对照品。
计算方法比较复杂，我就说个外标法，不需要校正因子的计算方法：
将对照品和样品配制相同浓度，分别进样分析。
含量（%）=样品峰面积/对照品峰面积*对照品浓度/样品浓度*100%

计算时你就记住，样品的峰面积和浓度呈正比。写完公式上下单位一致就完了。

Ⅷ 阿那格雷hplc分析方法

【摘要】研究目的：为测出十二名健康志愿者单次口服盐酸阿那格雷胶囊和多次口服给药后，不同时刻血浆样品中阿那格雷的浓度。本次研究建立了一种灵敏度高、分析时间短、重现性好、样品处理简便，适于样品高通量分析的LC-MS/MS（液相色谱-质谱法）定量方法。通过试验数据对口服盐酸阿那格雷胶囊后的体内药动学进行分析，为阿那格雷后期临床安全性、合理用药提供了可靠的依据。研究方法：使用乙醚-二氯甲烷（2:1，v/v）作为提取试剂，对阿那格雷血浆样品采用液-液萃取法进行前处理，柱温调节到35C，流速选择1.0mL/mi（n分流体积比1:1），吸清液层30μL进行LC-MS/MS检测分析。阿那格雷与内标格列吡嗪经AscetnisC18柱（4.6×150mmI.D.，5μm粒径），在流动相为甲醇-0.1%甲酸水（80:20，v/v）的色谱系统中予以分离之后，再通过高效液相质谱进行分析检测。选用MRM模式，即多重反应监测技术，选择ESI(电喷雾离子化源)作为离子源，正离子模式扫描阿那格雷和内标格列吡嗪，分别以m/z256.3m/z199.0和m/z446.1m/z321.0为定量分析的离子反应。为了确保建立的阿那格雷定量分析方法有效可靠，试验对如下指标进行了全面的方法学确证：包括其特异性、线性范围、最低定量下限、准确度、精密度、基质效应、提取回收率和稳定性等。对招募的十二名健康志愿者，口服给予盐酸阿那格雷胶囊各1mg以及多次口服1mg剂量后，为测出不同时刻采集的血浆中阿那格雷的浓度，使用已经建立好的HPLC-MS/MS定量方法来进行分析。为了了解阿那格雷在人体内的药代动力学所具备的特点，我们使用DAS3.0和SPSS17.0软件算出相应的药代动力学参变量并用统计学方法阐明其药代动力学参变量的特征。研究结果：为了测出人体血浆中阿那格雷的浓度，此次实验创建了快速灵敏、准确可靠、重现性极好且稳定的HPLC-MS/MS测定方法。结果表明：在待测物和内标格列吡嗪出峰时间处均没有外源性和内源性物质影响的情况下，阿那格雷血浆样品的定量线性范围是0.1-100ng/mL，LLOQ是0.1ng/mL，本方法线性良好(r=0.9971)，且定量范围较宽。日内精密度(日内RSD)<5.92，日间精密度(日间RSD)<10.4，准确度为3.11%-4.04%，以上值均<±15%。阿那格雷低、中、高三个浓度回收率分别是96.1±3.6%、99.5±1.2%、104±0.91%。内标格列吡嗪回收率也稳定，结果精密可重现。阿那

Ⅸ 高效液相色谱法研究分析方法学有哪些

方法验证有很多了,论述如下,来源CDE黄晓龙部长的文章
在进行质量研究的过程中,一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证,以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制.为规范对各种分析方法的验证要求,我国已于2005年颁布了分析方法验证的指导原则.该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述.但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准,国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求.另一方面,大多数药品研发单位在进行质量研究时,已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性,大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证,但验证完后却因没有一个明确的可接受标准,而难以判断该分析方法是否符合要求.本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求,提出了在对含量测定方法进行验证时的可接受标准,供国内的药品研发单位在进行研究时参考.
1．准确度
该指标主要是通过回收率来反映.验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份,分别测定其含量,将实测值与理论值比较,计算回收率.
可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间,9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%.
2．线性
线性一般通过线性回归方程的形式来表示.具体的验证方法为：
在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液,分别测定其主峰的面积,计算相应的含量.以含量为横坐标（X）,峰面积为纵坐标（Y）,进行线性回归分析.
可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998,Y轴截距应在100％响应值的2％以内,响应因子的相对标准差应不大于2.0%.
3．精密度
1）重复性
配制6份相同浓度的供试品溶液,由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试,所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%.
2）中间精密度
配制6份相同浓度的供试品溶液,分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试,所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%.
4．专属性
可接受的标准为：空白对照应无干扰,主成分与各有关物质应能完全分离,分离度不得小于2.0.以二极管阵列检测器进行纯度分析时,主峰的纯度因子应大于980.
5．检测限
主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3.
6．定量限
主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10.另外,配制6份最低定量限浓度的溶液,所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%.
7．耐用性
分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时,仪器色谱行为的变化,每个条件下各测试两次.可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0,主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%.
8、系统适应性
配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析,主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%,主峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%.另外,主峰的拖尾因子不得大于2.0,主峰与杂质峰必须达到基线分离,主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定.

Ⅹ 请问HPLC是做什么的原理操作方法

HPLC是高效液相色谱，英文全称是High Performance Liquid Chromatography。该方法在化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中被用来做重要的分离分析技术。

用途：高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。

原理：高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析和分离。

操作方法：如下图所示，溶剂贮器中的流动相被泵吸入，经梯度控制器按一定的梯度进行混合然后输出，经测其压力和流量，导入进样阀（器）经保护柱、分离柱后到检测器检测，由数据处理设备处理数据或记录仪记录色谱图，馏分收集器收集馏分，废液瓶收集废液。

(10)hplc分析方法扩展阅读：

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

HPLC根据固定相和流动相的成分分为正相色谱和反向色谱。

正相色谱法

采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8)；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

参考资料：网络-高效液相色谱