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组蛋白翻译后修饰研究常用方法

发布时间:2024-11-14 00:49:33

① ​Nature子刊:手把手教你入手蛋白乙酰化修饰研究

蛋白翻译后修饰作为生命科学领域长盛不衰的研究热点,对理解生命活动的复杂性至关重要。其中,蛋白乙酰化修饰不仅在细胞核内参与调控基因转录,还广泛出现在非组蛋白上,覆盖代谢、免疫、细胞周期、DNA损伤修复、凋亡、自噬等生命过程,展现出其多维的生物学功能。

对于初涉蛋白乙酰化修饰研究的科研新手,如何快速入门?以一篇2019年发表在Nature Communications上的自噬领域研究论文为例,可以提供一个简明的研究思路。

首先,确定目标蛋白是否存在乙酰化修饰。研究者通过使用去乙酰化酶抑制剂,如TSA和NAM,观察内源及外源p62在细胞中的乙酰化水平,发现只有TSA处理能显着提高,提示p62的去乙酰化过程由HDACs而非Sirtuins介导。

接着,探究乙酰化水平的调控机制。作者采用饥饿及蛋白酶体抑制剂等刺激处理,发现饥饿条件能够显着提高p62的乙酰化水平,说明蛋白的乙酰化受到特定条件的调控。

确定乙酰化转移酶。在哺乳动物细胞中,p300、CBP、PCAF、GCN5和TIP60等乙酰化转移酶在蛋白乙酰化修饰中扮演关键角色。通过细胞内筛选,发现TIP60的高表达能显着提高p62的乙酰化水平。

随后,研究去乙酰化酶。鉴于p62的去乙酰化过程被HDACs调控,作者通过细胞内筛选,发现HDAC6的高表达能显着降低p62的乙酰化水平,表明HDAC6是p62的去乙酰化酶。体外实验证实HDAC6可以直接去乙酰化p62。

确定乙酰化位点。通过质谱鉴定或体外乙酰化反应结合质谱鉴定,确定乙酰化位点。赖氨酸(K)是乙酰化的主要位置,通过构建突变体验证乙酰化或去乙酰化状态。

解析乙酰化对目标蛋白的影响。构建模拟乙酰化/去乙酰化突变体,研究乙酰化如何影响目标蛋白的功能,比如结合泛素的能力、形成二聚体的稳定性等。

探讨乙酰化修饰的生物学功能。在细胞水平或动物模型中研究目标蛋白乙酰化的生物学效应,例如在自噬过程中p62与泛素化蛋白降解的关联性及其对细胞活力的影响。

综上所述,蛋白乙酰化修饰的研究框架包括确定存在性、调控机制、酶的识别、影响解析及生物学功能探究,为深入理解蛋白乙酰化在生命过程中的作用提供了路径。

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