苯氨基乙氰含量分析方法

1. 氨基酸分析法的方法分类

本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～1.25µmol/ml。
试剂 （1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流动相B 乙腈－水（8：2）。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 100 0 14 85 15 29 66 34 30 0 100 37 0 100 37.1 100 0 45 100 0 测定法 精密量取氨基酸对照品溶液200μl，置一2ml塑料离心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混匀，精密加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混匀，室温放置1小时，加0.8ml正己烷，剧烈振摇，放置10min，精密取下层溶液2μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液200μl，自“置一2ml塑料离心管中”起同法测定。 本法系根据氨基酸与6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）反应，生成有紫外与荧光响应的不对称尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸经反相高效液相色谱后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为2.5～200nmol/ml。
试剂 （1）流动相A 取醋酸铵10.8g或无水醋酸钠11.5g，加水900ml溶解，用磷酸调pH至5.0，然后加水至1000 ml。
（2）流动相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至8.8，然后加水稀释至500ml。
(4) AQC溶液 取AQC适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.4ml；柱温为37℃；检测波长为248nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 88 12 14 88 12 29 80 20 30 59 41 37 59 41 37.1 88 12 45 88 12 测定法 精密量取对照品溶液10μl，置一直径为0.4cm、高度为5cm的小试管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 70μl，在涡旋混匀器上混匀，精密加入AQC溶液20μl，混匀，精密量取5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液10μl，自“置一直径为0.4cm”起同法测定。 本法系根据一级氨基酸，在巯基试剂存在下，首先与邻苯二醛（OPA）反应，生成OPA-氨基酸；反应完毕后，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩余的二级氨基酸与FMOC继续反应，生成FMOC-氨基酸，两次反应生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～2.5µmol/ml。
试剂 （1）流动相A 称取醋酸钠7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氢呋喃24ml，混匀，用2%醋酸调pH至7.2。
（2）流动相B 称取醋酸钠10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸调pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混匀。
（3）0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至10.4，然后加水稀释至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巯基丙酸125μl ，混匀 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×150mm， 5μm）；柱温为40℃；检测波长为338nm（一级氨基酸），262nm（二级氨基酸）。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度及流速如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min） 0.0 100 0 1.0 17.0 50 50 1.0 45.0 0 100 1.0 45.1 0 100 1.5 50.0 0 100 1.5 50.1 100 0 1.0 53 100 0 1.0 测定法 精密量取对照品溶液50μl，置一1.5ml塑料离心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.2) 250μl，混匀，精密加OPA衍生剂50μl，混匀，放置30秒，精密加入FMOC衍生剂50μl，混匀，精密量取4μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液50μl，自“置一1.5ml塑料离心管中”起同法测定。
附注：1、由于OPA-氨基酸不稳定，因此衍生后应立即进行分离测定。
2、本方法的衍生过程也可由自动进样器完成。 本法系根据氨基酸与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成有紫外响应的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸经反相高效液相色谱分离后采用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯属易爆、剧毒物质，有强致癌性，且该法对色谱柱要求较高，易损坏色谱柱，衍生试剂水解生成的2，4-二硝基苯易干扰丝氨酸的测定。除另有规定外，一般不宜采用本法。
试剂 （1）流动相A） 0.05mol/L醋酸钠溶液(取 4.1g无水醋酸钠，加水800ml溶解，加二甲基甲酰胺10ml，用稀醋酸调pH至6.4，用水稀释至1000 ml)。
（2）流动相B 流动相A-乙腈（1：1）。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为360nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 75 25 6 75 25 6.1 65 35 11 59 41 14 59 41 14.1 50 50 22 45 55 32 10 90 37 10 90 39 75 25 50 75 25 测定法 精密量取氨基酸对照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化试剂（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀释至100ml）1ml，混匀，在60℃水浴中反应 1小时，取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液2ml，自“置一50ml量瓶中”起同法测定。 本法系根据氨基酸经阳离子交换色谱柱分离后，与茚三酮反应，一级氨基酸生成在570nm处具有最大吸收的紫色化合物，二级氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黄色化合物，分别在570nm和440nm下检测上述反应产物，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为20～500 pmol。
试剂 （1）流动相A 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸1.5ml，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至3.0。
（2）流动相B 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸0.7ml，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至4.3。
（3）流动相C 取氯化钠5g，无水柠檬酸钠1.9g，苯酚0.1g，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至6.0。
（4） 色谱柱再生溶液 取氢氧化钠0.8g，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至13。
（5）柱后衍生试剂 取茚三酮18g，茚氮兰0.7g，加76.7%二甲基亚砜－0.7二水合醋酸锂－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮气下混合至少3小时。
（6）样品缓冲液 2%无水柠檬酸钠-1%盐酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物为填充剂（4.0×120mm， 7.5μm）；流动相流速为每小时14.0ml；柱后衍生试剂得流速为每分钟7ml，反应器温度为135℃；检测波长为440nm(一级氨基酸)，570nm（二级氨基酸）。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下：开始时用流动相A平衡色谱柱，在25分钟流动相的组成变为100%流动相B，在37分钟，流动相组成变为100%流动相C，在75min，最后一个氨基酸被洗脱后，用色谱柱再生溶液再生色谱柱1分钟。柱温程序如下：开始时柱温48℃，11.5分钟后，以每分钟3℃的速率升至65℃，约35分钟后，以每分钟3℃的速率升至77℃，最后在约52分钟后，以每分钟3℃的速率降至77℃。
测定法 精密量取氨基酸对照品溶液适量，注入氨基酸分析仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液适量，同法测定。
附注：不同品牌的氨基酸分析仪，应根据仪器的要求，对流动相、色谱柱再生溶液、衍生试剂、缓冲液和洗脱梯度作适当调整。

2. 气相色谱法可以测定蔬菜水果中的什么含量

气相色谱法同时测定蔬菜及水果中多种农药残留量

【摘要】建立了蔬菜中乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、环氟菌胺、氟虫腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚虫威残留量气相色谱同时分析方法。采用分散固相萃取技术，在提取液中加入C18、石墨炭黑、PSA等吸附剂粉末进行净化，根据检测器选择溶剂置换，采用DB1701毛细管柱分离，μECD检测。13种农药的浓度范围在0.002～0.05mg/kg时，回收率在80%～100%之间、RSD为1%～6%。各农药的检出限为：氟虫腈、环氟菌胺0.002mg/kg；苯氧菊酯、甲草胺、乙草胺0.004mg/kg；多效唑、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚虫威0.01mg/kg。该方法步骤简单，净化效果好，具有良好的灵敏度、回收率和重现性。

1、引言

农药残留和食品安全问题在国际社会受到广泛关注，食品农产品的农药残留检测项目日益增多、限量要求日益严格。在分析仪器高度发展的今天，样品的处理技术在农药残留分析中占据越来越重要的位置。现在的前处理技术多采用自制填充柱、SPE小柱或基质固相分散技术[1,2]。采用填充柱净化法和基质固相分散技术费时并消耗大量的有机试剂；采用SPE小柱净化，经常多种结合使用，导致成本较高。2003年美国农业部提出了分散型固相萃取技术[3]，关于此净化方法，现有文献[4～6]中大部分只采用PSA净化，PSA吸附剂具有弱的阴离子交换能力，有利于吸附样品基质中的有机酸、糖以及色素，但对于基质复杂的蔬菜净化效果并不太理想。本方法在实验的基础上创新性的增加了C18、石墨炭黑等吸附剂粉末同时净化，根据气相色谱μECD检测器进行溶剂转溶，实现了对基质复杂的蔬菜中乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、环氟菌胺、氟虫腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺及茚虫威等多种农药残留的快速检测。

2、实验部分

2.1仪器和试剂

Agilent6890N气相色谱仪，配μECD检测器、自动进样器；涡流混匀器（IKA公司）；研磨机（德国GM公司）；离心机（中国安亭公司）；电子天平（梅特勒公司）；均质器（IKA公司）。乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、环氟菌胺、氟虫腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚虫威等农药标准品（Dr.公司的有证标准物质）；正己烷、丙酮、乙腈均为色谱纯；冰醋酸：优级纯；无水乙酸钠：分析纯；无水硫酸镁：分析纯（500℃马弗炉内烘5h，冷却取出装瓶备用）；PSA粉；C18粉；氨基粉（NH2）；石墨碳黑粉；0.1%冰醋酸/乙腈溶液（移取1mL冰醋酸加入1000mL乙腈混匀）。

2.2实验方法

2.2.1标准工作液的配制

称取乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、环氟菌胺、氟虫腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚虫威标准品各10.0mg,用丙酮溶解后，置于13个100mL棕色容量瓶中，并用丙酮定容至刻度，混匀，浓度分别为100mg/L，分别移取以上标准液氟虫腈、环氟菌胺（A组）各1.0mL,甲草胺、乙草胺、苯氧菊酯（B组）各2.0mL,多效唑、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚虫威（C组）各5.0mL置于100mL棕色容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，A组、B组和C组标准溶液浓度分别为1．0、2．0和5．0mg/L。

2.2.2样品制备及提取、净化

称取样品适量，置于100mL塑料离心管中，加入0.1%醋酸/乙腈溶液10mL，正己烷5mL，无水硫酸镁5.0g,无水乙酸钠2.0g，用玻璃棒充分搅拌均匀，于均质机上高速均质2min，5000r/min高速离心8min，移取全部上清液于15mL塑料离心管中，氮气吹干，准确加入0.1%醋酸/乙腈 正己烷溶液（1 1）2mL溶解残渣,1400r/min涡漩混合2min，溶解液转移入盛有适量PSA、C18粉、石墨碳黑粉的离心管中。以1400r/min涡漩混合2min离心。取上清液1mL，置于离心管中氮吹至近干，用正己烷溶解，定容至1mL，过0.22μm滤膜，供GC测定。若样品为含硫醚类化合物蔬菜[7,8]如葱、蒜苔等，根据样品情况切块或切段，采用格兰仕微波炉中火加热30s，样品再打碎称取适量进行提取及净化。

2.2.3色谱条件

DB1701毛细管柱（30m×0.32mm，0.25μm）；载气：高纯氮，纯度＞99.999%；柱温：60℃（1.25min）20℃/min180℃（7min）（10℃/min）230℃（7min）（10℃/min）270℃（15min）；柱流速：1.4mL/min，恒流；进样口温度：250℃;检测器：μECD；检测器温度：300℃；进样量：1μL。

3、结果与讨论

3.1吸附剂粉末的优化选择

在相同混标溶液中分别加入PSA、石墨碳黑、C18、氨基粉等不同的吸附剂粉末处理，每组6个平行样，所得的回收率数据见表1，石墨炭黑粉等去除色素等杂质的效果好，但是对茚虫威吸附较强、用量要适量，氨基粉与PSA净化效果相同，但氨基粉对多种农药的吸附性均较强，C18和PSA对上述13种农药回收率影响较小。所以本实验选择PSA、石墨碳黑、C18为吸附剂加强净化效果。表113种农药的混合标准品分别经4种吸附剂处理后的回收率（略）

3.213种农药在不同基质中的回收率

吸附剂粉末的用量也是影响前处理效果的重要因素，应根据样品情况和目标物性质通过实验选择合适的吸附剂用量。对于蔬菜样品吸附剂粉末用量范围一般为：PSA粉100～200mg、C18粉100～200mg、石墨碳黑50mg。方法中样品为菠菜、黄桃、胡萝卜，样品色素重，如果仅采用PSA，色素及干扰物去除效果不理想，净化液颜色较深、干扰峰多、基线高，结果难判断及定量（图1a）。所以实验采用150mgPSA、150mgC18、石墨碳黑粉50mg，净化效果较好，净化液呈浅色或无色，目标峰附近无大干扰峰（图1b），添加回收率见表2（浓度为0.01mg/kg）。表213种农药（浓度均为0.01mg/kg）在胡萝卜、黄桃、菠菜样品中的回收率。

3.313种农药的保留时间、线性范围、相关系数及检出限

取系列浓度的混合标准工作液，依次进样，以色谱峰面积对浓度作标准曲线，得13种农药的线性方程及相关系数，在0.05～10mg/L之间线性关系良好。表313种农药保留时间、线性范围、相关系数和检出限。

3.4方法回收率、精密度

在已知不含农药残留的菠菜样品中分别加入不同浓度的混合标准工作液（A、B、C3组的混标溶液），按本方法进行提取、净化和检测，以峰面积计算各种农药在0.002～0.05mg/kg添加水平的回收率（同一水平样品组n=6），计算各农药的平均回收率及相对标准偏差（见表4），标准品谱图见图2（0.1mg/L）、添加回收谱图见图4（0.01mg/kg）,氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯在本实验中所采用的DB1701的色谱柱上不能完全分离，但在DB5色谱柱上可完全分离。方法检出限为：氟虫腈、环氟菌胺均为0.002mg/kg;苯氧菊酯、甲草胺、乙草胺均为0.004mg/kg；多效唑、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚虫威均为0.01mg/kg，完全满足蔬菜中农药残留量的检测要求。表413种农药的回收率实验结果。

3.5小结

本方法用分散型固相萃取气相色谱法对蔬菜中的乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯等13种残留进行检测。根据蔬菜样品情况及目标物性质选择多种吸附剂粉搭配使用，并对其用量进行实验确定。此净化方法减少了杂质干扰，色谱峰分离度好，具有良好的精密度及较低的方法检测低限。通过对100批样品的检测和协作实验室验证了本方法的实用性。
文章链接：中国化工仪器网 http://www.chem17.com/News/Detail/21574.html