体内药物分析常用血清处理方法

1. 阿司匹林的含量怎么测定

阿司匹林含量测定综述 08药学1班：冉贤飞
阿司匹林片为常用的解热、镇痛药，收载于(中国药典2000年版)二部。原含量测定方法为酸、碱中和滴定法。目前市场上流通的解热、镇痛药物中，含阿司匹林或以阿司匹林为主药的较多。除了中国药典的原含量测定方法以外，针对各个剂型有多种含量测定的方法。如采用高效液相法测定其含量，可消除其他含有酸、碱的物质对其测定的干扰，可更有效的控制制剂的质量。方法操作简便，专一性强，结果准确。也有用数学模型进行计算的如近红外漫反射技术，其原理是根据标样集中样品的近红外光谱运用化学计量学方法建立光谱特征值(如吸光度)与待测成分之间的数学关系(简称数学模型)

1．阿司匹林及阿司匹林制剂的含量测定
阿司匹林及阿司匹林制剂的含量测定有多种方法，其中包括药典所载的酸、碱中和滴定法
及紫外分光光度法，高效液相法等。
1．1阿司匹林酸碱滴定法：
直接滴定：方法：取本品0。4g，精密称定，加中性乙醇20ml，溶解，加酚酞指示液3d，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）滴定。每1ml滴定液相当于18。02mg 的C9H8O4
水解后剩余滴定：方法：取本品1.5g，精密称定加氢氧化钠滴定液（0.5mol/l）50.0ml，混合，缓缓煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/l）滴定剩余的氢氧化钠。
两步滴定法：取本品10片，精密称定，研细，精密称取片粉适量（约相当于阿司匹林），加中性乙醇20ml,振摇使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3d，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）至溶液显粉红色。加定量过量的氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）40ml，置水浴上加热15min并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液（0.05mol/l）滴定剩余的碱。根据消耗的滴定液体积及滴定度计算含量

1．2阿司匹林制剂的电极法测定
仪器与试剂：电极电位和溶液酸度测试均使用pHs—loC型数字式酸度离子计；参比电极为232型饱和甘汞电极；试剂均为分析纯，实验用水为去离子水经高锰酸钾处理后蒸馏而得。
电极制备：将载体物质三苄基锡辛酸酯20mgl聚氯乙烯（PVC）0．33g和增塑剂邻硝基苯基辛醚o．65g溶解于四氢呋喃（THF）3g中，搅拌澄清后将其倾倒于40 mm×40 mm的水平玻璃板上。待THF挥发完后(约需l 2h)即得到具有弹性的PVC膜。用打孔器切下直径10 mm的圆片并用含5％PVC的THF溶液粘于PVC电极杆端,放置数小时,晾干后电极杆内充以0.1mol／L的水杨酸钠溶液作为内参比溶液并以Ag／AgCl丝作为内参比电极导出至离子计。电极使用前需于0.01mol／l水杨酸钠溶液中浸泡2h进行活化处理。电极及备用膜长期不使用时可洗净后．置于氮气氛围下保存。在此条件保存，电极的各项性能指标至少可于5个月内维持稳定。
阿司匹林制剂的分析：待测样品的处理： 阿司匹林易水解得到水杨酸根离子，且反应定量。因此，通过对水杨酸根离子的测定即可得出样品中的阿司匹林含量。阿司匹林片(A)和复方阿司匹林片（B）均处理如下：将适量药品(10片)研制成粉状，精密称取1—1．5g．在0.5mol／L NaOH溶液25m1中加热回流1h后过滤，定容至250 ml。吸取lOm1滤液，用稀硫酸调至pH 5．5，再用PH 5．5的磷酸盐缓冲液定容至100 mI作为待澜液。使用所配电极通过标准溶液法和样品加入法．分别测定药品A和B经前述处理后所得试样中的水杨酸根离子浓度，通过换算得出药剂中阿司匹林的含量

1．3 HPLC法测定阿司匹林片的含量
仪器与试药 仪器：高效液相色谱仪；CLASS—LC工作站。色谱柱：ODS C18色谱柱(150mm x 4．6mm，填料：Kromasil，粒度：5um)。 试药 阿司匹林对照品，甲醇(色谱纯试剂)，冰醋酸、盐酸(分析纯试剂)。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于阿司匹林10mg)，置100m1量瓶中，加0．1mol/l盐酸溶液适量，超声使阿司匹林溶解，放冷至室温，加0．1mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5m1，置25m1量瓶中，加0．1mol/l盐酸溶液稀释至刻度，格匀，取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。另取阿司匹林对照品适量，加0．1mol/l盐酸溶液溶解并稀释制成每l m1中约含阿司匹林20ul的溶液，取20ul同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

1．4动力学光度法测定痕量乙酰水杨酸
原理：碘对Ce4+和As的氧化还原反应有明显的催化作用，乙酰水杨酸和碘容易发生取代反应，使碘的浓度降低，导致碘的催化作用减弱，由此建立动力学光度法测定痕量乙配水杨酸的新方法。
仪器和试剂：721型分光光度计；PHS—3C酸度计；超级恒温水浴。0．01mol/lCe(SO4)2 0．013mol/L AS2O3，5mol/l H2S04 , 5mg/l KI用时稀释至0．25mg/l ;150mg/l乙酰水杨酸标准溶液用时稀释至所需浓度；5％醋酸马钱子碱；实验用水为二次蒸馏水。
实验方法:于一系列25m1比色管中准确加入0．25mg/lKI溶液1．0m1，5mol/l H2S04溶液1．25m1，0．013mol/L AS2O3溶液1.0ml，乙酸水杨酸标准溶液(或样品溶液)，加蒸馏水至25m1刻度线。摇匀并放人35土0．1度的水浴中，恒温后加入0.01mol/l Ce〔S04)2 1.0ml，立即摇匀，迅速放回水浴中。反应10min后，加入0.5mol/l,0.5％的醋酸马钱子碱终止反应并与Ce4+—显色，置于沸水浴中煮沸3min，取出冷却至室温。用1cm比色皿，在波长520nm处，以蒸馏水为参比，测定吸光度A。

2．以阿司匹林为主药的含量测定
虽然其成分组成有差异，但大多仍是根据阿司匹林的化学或色谱性质加以分离并测定其含量。
2．1反相高效法相色谱法测定阿司匹林可待因片中阿司匹林含量
仪器和试剂：Hp-1050液相色谱仪及UV检测器，HP3396积分仪。磷酸可待因对照品、阿司匹林对照品 。甲醇、醋酸钠、冰醋酸均为分析纯试剂，阿司匹林磷酸可待因复方制剂(试制品)。
液相色谱条件：色谱柱ODS C18(10mm，300mm×4mm) 流动相：甲醇—0．03mol/L—l醋酸钠(冰醋酸调pH＝3．5)(1：2．5)；检测波长：280nm；流速：1ml/min.
测定方法
混合对照品溶液配制 准确称取在105℃干燥至恒重的磷酸可待因对照品适量。用水溶解，配制成浓度为0.8mol/l的溶液。准确称取阿司匹林对照品约40ml置10mL容量瓶中。加入甲醇2—3mL，溶解，精密加入上述磷酸可待因溶液1.0mL，用水定容至刻度，摇匀即得。
供试品溶液配制 精确称取样品细粉适量(约相当磷酸可待因8mg阿司匹林400mg)置100mL容量瓶中，加入25％甲醇溶液50mL，超声溶解5min。用25％甲醇溶液稀释至刻度，格匀。经0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液为供试品溶液.
测定 精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10uL，分别注入液相色谱仪中。记录峰面积。根据混合对照品溶液中磷酸可待因和阿司匹林的峰面积，计算出供试品溶液中二者的含量.

2．2小儿退热灵片紫外折合光谱测定
原理：摺曲线分析法是一种数学变换方法(它的数学属性是一种新的复合导数变换)。它根据谐波分析原理，将光谱吸收曲线看作是多个数学分量加权而成。由于它提供的信息量大，可以显示吸收曲线的细微差异，以减少相似组分的数学相关性，所以在物质定性和混合物定量方面具有明显的优点。
仪器与试药：UV／VIS W型裙合光谱仪及裙合光谱软件；阿司匹林(1)对照品(含量99．89％)、苯巴比妥(2)对照品(含量99．92％)和辅料(佳木斯化学制药厂)；小儿退热灵片
方法与结果：对照品溶液的配制：分别精密称取1、2对照品适量，用0．1mol／LNaOH溶液(溶剂)溶解稀释制成1mg／m1的储备液。再用溶剂稀释制成适当浓度的溶液(约120ug／m1，22．0ug／m1，使1和2的吸收度在0.2—0．8)，备用。模拟样品的配制 按原黑龙江地方标准药品处方比例称取1、2与适量的辅料混匀后，精密称取0．2g置小烧杯中，用溶剂溶解并定容至100m1，静置10min，再取5m1稀释至250m1。分别吸取16、17、18、19和20m1置各25m1量瓶中，用溶剂定容，得1浓度为20—25ug／m1、2浓度为2．0—2．5ug／m1的模拟样品溶液(使1和2的吸收度在0．2—1．2)，共5份。
样品测定：取本品12片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于10．110g，20．011g)，用少量溶剂溶解后定容至50m1。按“2．3”项下方法选定的最佳折合区间(245—295nm)，经折合光谱自动采集该区间的光谱信息，以两组分定量分析系统软件进行裙合运算，并计算得含量

2．3近红外漫反射技术测定精氨酸阿司匹林的含量
原理：近红外定量分析需要一个待测成分已知的标准样品集(简称标样集)，根据标样集中样品的近红外光谱运用化学计量学方法建立光谱特征值(如吸光度)与待测成分之间的数学关系(简称数学模型)。当测定未知样品时，只需测定该样品的近红外光谱，然后用已建好的数学模型预测出待测成分的含量。与常规的光谱定量分析不同之处是，近红外光谱分析时所用样品可以不经预处理，通过求解光谱矩阵与待测成分的浓度矩阵来建立数学模型，进行定量。检测固体样品一般采用漫反射技术，对于液体样品的检测用透射方法。建立数学模型的方法主要有：多元线性回归、主成分法、偏最小二乘法等。贴算法相对而言是一种较新的多元数据处理技术，它与逐步回归、主成分回归的显着差异在于考虑全谱区各波长是光谱参数的同时，还兼顾了被分析样品内部各成分之间的关系，因此在NIR分析中得到广泛应用。
仪器：Bruker公司VECTOR22/N近红外光谱仪,带漫反射光纤探头波长区间4000-11000cm-1
样品: 精氨酸阿司匹林固体粉末含阿司匹林48．0％-53．0％, 蔗糖酯(片剂辅料，作为润滑剂)
实验方法：用1／1000扭力天平准确称取不同比例的精氨酸阿司匹林与蔗糖酯，共10份，分别混合均匀，用压片机压片，得到精氨酸阿司匹林含量不同的片剂(以此含量做为精氨酸阿司匹林片的理论含量一真值)，每种各100片。从每种100片中随机选取10片，用仪器的漫反射光纤探头压住药片，每片正反面各测1次，取平均光谱做为样品光谱。扫描区间为4000-11000cm-1，分辨率为8cm-1。用Bruker公司Bruker公司quant/2软件分析，光谱数据采用加性散射校正预处理，以消除药片表面不同引起的误差，即可得到测量值。

2．4阿司匹林精氨酸盐注射液含量测定
仪器与试药： 仪器 79—l电磁搅拌仪；紫外—可见分光光度计。精氨酸，阿司匹林，其余试剂均为分析纯。
标准曲线的绘制：精密称取阿司匹林结晶250．0 mg，悬浮于250mL蒸馏水中，在40一50度水浴中不断搅拌至溶解，冷却后移入500 ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。精密吸取l，2，3，4，5mL分别置于50 mL量瓶中，加25mL蒸馏水，用o．1mol/LNaOH溶液调节pH至9一10，在沸水浴中加热5min，冷却后，用0.1mol/l盐酸溶液调节pH至3.0一4.0，加5滴硫酸铁铵指示液，再加蒸馏水至刻度，摇匀。在530 nm波长处测定吸收度A。线性回归得方程.
测定含量：精密称取阿司匹林精氨酸盐400．0 mg置l00mL量瓶中，加蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，过滤。取续滤液5mL，置50 mL量瓶中，在沸水浴中加热数分钟，冷却，加25mL蒸馏水，以下同标准曲线项下处理，在530 nm波长处测定吸收度A，计算阿司匹林精氨酸盐的含量。阿司匹林精氨酸盐的含量＝(测定值／称量值)×loo％，代入数据求得阿司匹林精氨酸盐的含量.

3．阿司匹林体内药物分析：
3．1反相高效波相色谱法测定阿司匹林血药浓度
1 仪器与试药：Waters2690高效液相色谱仪，配置有996二极管阵列检测器及Millennium数据处理系统；旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；TGL—16高速离心机(上海医用仪器厂)。 水杨酸、苯甲酸对照品(中国药品生物制品检定所)；磷酸为分析纯，乙睛为色谱纯；水为超纯水。
色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱(4．6mm×250mm，5um)，流动相为甲酵—乙睛—0．2％磷酸(18：32：50)，检测波长为237nm，流速为1.0ml／min。
溶液配制： 精密称取10．10mg水杨酸对照品，用甲酵溶解，并定容至10ml，得到1．010mg／L水杨酸的储备液，并用甲醇稀释成不同浓度的系列溶液。精密称取10．44mg苯甲酸，用甲酵溶解，并定容至10ml，得到1．044mg/l苯甲酸的储备液。取lml储备液，用甲醇稀释至loml，得到104．4ug／ml的内标工作液。
样品处理与测定：精密量取血清样品0．5nl，加入内标苯甲酸溶液(104．4ug／m1)50ul，乙睛2ml，旋涡振荡2min，15000r／min离心5min，取上清夜20ul，在上述色谱条件下进样，分别记录内标与样品的色谱图与峰面积。按外标法以峰面积计算，即得。

讨论
阿司匹林及其制剂有多种分析方法，但有其共同点。HPLC分析中，检测柱一般多采用C18柱，检测波长为280左右。滴定法都是根据药物中含游离羧酸的酸性进行滴定，或水解后用酸回滴。其他以数学模型等方法进行的测量，也都是基于阿司匹林的化学结构和性质。

参考文献：
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2. 体内药物分析的样品处理

体内样品的预处理方法的选择需要综合考虑多种因素，包括体内样品的种类、被测药物的性质和浓度、以及所采用的测定方法等三方面。
如血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；尿液样品则常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出；唾液样品主要采用离心去除黏蛋白沉淀。
被测定药物的结构、性质、存在形式与浓度范围等，均直接影响到样品前处理方法的选择与应用。例如，药物的酸碱性（pKa）与溶解性影响到药物的萃取分离条件的选择，药物的极性、稳定性、官能团性质和光谱特性影响到其色谱测定条件的优化选择。不同药物在样品中的浓度相差悬殊，浓度大的样品对前处理要求稍低，浓度越低则样品前处理要求越高。
体内样品前处理的方法以及分离纯化的程度，均取决于测定要求和所采用的测定方法。测定方法的耐受污染程度和抗干扰能力越强、专属性越好、灵敏度越高，则对前处理的要求越低。通常，免疫测定法由于具有较高的灵敏度和抗干扰能力，体内样品只需经离心分离即可直接用于测定。而高效液相色谱和色谱-质谱联用等方法，为防止蛋白质等在色谱柱上沉积、内源性干扰、或基质效应影响，色谱分析前均需对体内样品进行去除蛋白、溶剂萃取、甚至制备衍生物等前处理。
1.去除蛋白质法
在测定血样及组织匀浆等样品中的药物时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质既可使蛋白结合型的药物释放出来以便测定药物的总浓度，又可避免进一步的溶剂萃取过程中乳化的形成，并可消除内源性干扰，同时保护仪器性能（如保护HPLC柱不被蛋白污染），延长使用寿命。去除蛋白质常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法。
2.缀合物水解法
药物在体内经二相代谢可以形成葡糖醛酸苷或硫酸酯缀合物，并经尿液或胆汁排泄。为了准确测定体内样品中药物的含量，首先需将缀合物水解释放出缀合的药物或其代谢物后，再进行进一步的处理测定。常用的缀合物水解方法包括酸水解和酶水解。
酸水解通常使用无机酸，如盐酸或磷酸溶液等。酸的浓度、水解时间和温度等条件，应根据具体药物进行优化确定。酸水解的优点是简便、快速，但是专属性较差，并需注意避免药物的进-步降解。对于遇酸及受热不稳定的药物，可采用酶水解法。
酶水解法常用葡糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，或二者的混合物。酶解时应当注意控制反应的pH、酶试剂用量、孵育温度、酶解时间，并在厌氧条件下进行。尿液样本进行酶解时，需要首先隐蔽会抑制酶活力的阳离子。
虽然酶水解法存在水解时间长、酶试剂带人的黏液蛋白可能导致乳化及色谱柱污染等缺点，但酶水解法具有较高的选择性，很少使被测药物或共存物发生降解，所以常被优先选用。
3.分离纯化与浓集法
对于浓度较高的样品，或检测方法具有足够灵敏度时，体内样品在经去除蛋白质或缀合物水解等前处理步骤后即可直接用于测定。但当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，体内样品需进行分离、纯化与浓集处理，或在去除蛋白质或缀合物水解的基础上进一步进行处理。
萃取法是应用最多的分离、纯化方法。萃取的目的是为了从大量共存的内源性物质中分离出所需要的微量组分一药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集，残留物采用适宜的溶剂复溶后再进行分析测定。萃取法包括液-液萃取法和液-固萃取法。
4.化学衍生化法
治疗药物监测的体内样品色谱分析时，可根据待测物的化学结构和检测方法的要求，通过化学衍生化方法，特异性地引入功能基团后再进行分析。通常对药物分子中含有活泼H的极性基团，如含-COOH、-0H、-NH2、-NH-和-SH等，进行化学衍生化。化学衍生化的目的包括：改变待测药物的色谱行为；增强药物的稳定性；改善（手性拆分）分离能力；提高检测灵敏度等。
GC分析中常对待测物进行硅烷化（silylation）、酰化（acylation）、烷基化（alkylation）或酯化（esterification）等。硅烷化应用最广泛。硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（TMTS）等。酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐、五氟苯甲酸酐等。烷基化及酯化试剂有：五氟碘乙烷、重氮甲烷、对溴苄基溴、三氟化硼-甲醇等。
化学衍生化HPLC分析包括柱前和柱后衍生化两种方法。柱前衍生化分析中，衍生化胺、氨基酸和氨基醇类化合物的试剂有：丹酰氯、荧光胺、9-芴甲氧羰酰氯、邻苯二醛等；衍生化羰基化合物的试剂有：2，4-二硝基苯肼、丹酰肼等；衍生化羧酸常用的试剂为2，4'-二溴苯乙酮；衍生化醇类化合物常用的试剂为3，5-二硝基苯甲酰氯、五氟苯甲酰氯等。
由于柱前衍生化法是在分离前使药物与衍生化试剂反应。故与药物具有相同官能团的干扰物质也同样会生成衍生物，并有可能妨碍药物的检测。如果干扰物质含量高时，甚至会影响待测成分的衍生化效率。因此，应尽可能将样品进行分离纯化后再衍生化。
柱后衍生化是药物经色谱分离后在流出液中进行衍生化，以形成对检测器具有高灵敏度响应的衍生物，从而提高检测灵敏度。如氨基酸分析仪中的柱后茚三酮衍生化。
具有光学异构体的药物，由于R（-）与S（+）构型的不同，使之具有不同的药效和药动学特性。因此，异构体的分离检测十分重要。光学异构体的分离可采用不对称试剂衍生化，使其生成非对映异构体衍生物，再进行色谱分离测定。常用的不对称衍生化试剂有：（-）-1-（9-芴基）乙基氧甲酰氯、（+）-樟脑磺酰氯、2，3，4，6-四-O-苯甲酰-β-D-葡萄吡喃糖基异硫氰酸酯、（R）-（+）-1-（1-萘基）乙胺等。

3. 体内药物分析——测定前样品的制备

除少数体液经简单处理后直接测定外，通常在最后一步测定前要采取适当的样品制备，即进行分离、净化、浓集、必要时尚需对待测组分进行化学改性，为测定创造良好条件。

一、样品的制备要考虑：

药物的理化性质、待测物的浓度范围、药物测定的目的、选用的生物体液和组织的类型、样品制备与分析技术的关系。

二、蛋白质的处理：

是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。

（一）加入沉淀剂和变性试剂：硫酸铵是经典的蛋白质沉淀剂，它与蛋白质分子竞争系统中水分子，而使蛋白质析出。阴离子型沉淀剂（三氯醋酸、高氯酸、钨酸、焦磷酸）与带电荷的蛋白质在氏于等电点的pH时形成不溶性盐；反之，阳离子型沉淀剂（含锌盐、铜盐）与蛋白质分子中带阴电荷的羧基，在高于蛋白质等电点时，形成不溶性盐。有关机制不十分清楚。

（二）加入可与水混合的有机溶剂：乙醇过量存在时，能使与蛋白结合状态的药物释放可将混合物离心，取上清液（含药），但这不能解决样品的净化问题。蛋白沉淀法对于与蛋白结合力强的药物的回收率较差。也有采用酸消化法（Aciddigestion）使药物自蛋白结合处释出，但常导致药物的分解。

（三）组织的酶消化法：蛋白水解酶（Proteolyticenzyme）中的枯草菌溶素（SubtilisinCarlsberg）不仅可使组织酶解，且可使药物析出。

优点：1、因是在平稳条件下进行的，可避免某些药物在酸中水解及较高温度时降解；

2、可显着改善对蛋白结合率强的药物的回收率；

3、可用有机溶剂直接提取消化液而无乳化生成的危险；

4、在用HPLC时，无需再进行过多的净化操作。缺点是不适用于一些在高pH时易水解的药物。

4. 体内药物分析中为何要处理理生物样品中的蛋白质又该如何处理生物样品中的蛋白质

生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。
样品于测定前一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。
样品处理步骤与分析方法的选择—(一）去除蛋白质
在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。
1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。
2.加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。
3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。
5.酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不仅可使组织酶，并可使药物析出。
酶解法的优点是：可避兔某些药物在酸及高温下降解：对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显着改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化操作。酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物。
（二）缀合物的水解
尿中药物多数呈缀合状态。由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法。
（三）分离、纯化与浓集
对于大多数药物而言，生物样品的分析通常由两步组成：样品的前处理（分离、纯化、浓集）和对最终提取物的仪器分析。
提取法是应用最多的分离、纯化方法。提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集。提取法包括液-液提取法和液-固提取法。
1.液-液提取法（liquid-liquidextraction，LLE）
多数药物是亲脂性的，在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品。
2.液-固提取法（liquid-solidextration，LES）
液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法。也可以认为是规模缩小的柱色谱法。这种方法是应用液相色谱法原理处理样品。将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。
（四）化学衍生化
分离前将药物进行化学衍生化的目的是：（1）使药物变成具有能被分离的性质；（2）提高检测灵敏度；（3）增强药物的稳定性；（4）提高对光学异构体分离的能力等。
药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含有－COOH、－OH、NH2、、－NH－、－SH等官能团的药物都可被衍生化。
化学衍生化对GC和HPLC尤为重要。
1.GC中化学衍生化法药物的化学衍生化前处理对GC十分必要，衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而使GC的温度不必很高即可适合GC的分析要求。主要的衍生化反应有烷基化（alkylations）、酰化（acrylations）、硅烷化（silylations）等。其中已硅烷化用得最广泛。
常用的烷基化试剂有碘甲烷（CHI）、叠氮甲烷（CHN2）、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等；常用得酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐等；硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷（TMCS）、双－三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双－三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（IMTS）等。
具有光学异构体的药物，由于R（-）与S（＋）构型不同，使之具有不同的药效和药动学特性，因此，异构体的分离也是十分重要的。分离光学异构体的方法之一，就是采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。常用的称试剂有：（S）－N－三氟乙酰脯胺酰氯、（S）－N－五氟乙酰脯胺酰氯等。 #\?xJxT\?
2.HPLC中化学衍生化法当采用HPLC法时，其衍生化的目的是为了提高药物的检测灵敏度。一些在紫外、可见光区没有吸收或者摩尔吸收系数小的药物，可以使其与衍生成对可见－紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等具有高灵敏度的衍生物。
化学衍生化包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。由于柱前衍生化法是在分离前使药物与衍生化试剂反应，故与药物具有相同官能团的杂质也会同样生成衍生，这样就有可能妨碍药物的检测。同时，如果杂质含量多时，药物与衍生化试剂的反应率降低，因此，应尽可能将药物进行精制后再衍生化。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物，从而提高了选择性。HPLC常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。
在测定生物样品中药物及其代谢物时，样品的前处理是十分重要的。除了少数情况，将体液经简单处理后进行直接测定外，一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。生物样品进行前处理的目的在于：①药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙（gl uronides）、硫酸酯（sulphates）缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物；②生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na＋、K＋、X-等无机化合物］。其中影响最大的是蛋白质，若用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严重影响分离效果。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必须进行除蛋白等前处理。
一、常用样品的种类、采集和贮藏
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、金血）、尿液、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等。下面仅介绍常用的血样、尿样及唾液。
（一）血样 G\­(9M^6@y!
血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。
供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。对于病人，通常采取静脉血，有时根据血药浓度和分析方法灵敏度，也可用毛细管采血。由采集的血液制取血浆或血清。
血浆的制备 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中，混合后，以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离，分取上清液即为血浆。

血清的制备 将采取的血样在室温下至少放置30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼，然后以2000～3000rpm离心分离5～10min，分取上清液．即为血清。
血浆比血清分离快，而且制取的量多，其量约为全血的一半。但由于所用抗凝剂的种类不同，用血浆测定药物浓度有时不一致；血清的获取量小，但血清成分更接近于组织液的化学成分，测定血清中有关物质的含量，比全血更能反映机体的具体情况；同时，药物与纤维蛋白几乎不结合，因此，血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。基于上述原因，现在国外多采用“专用血清”来测定药物的浓度。
对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据，而全血的净化较血浆和血清更为麻烦，尤其是溶血后，血色素会给测定带来干扰。但在个别情况下也有采用全血测定药物浓度的。例如氯噻酮可与红细胞结合，其动力学行为与在血浆中不同，在血细胞的药物浓度比血浆药物浓度大50～100倍；又如一些三环降压药物，对个别患者来说，在血浆和红细胞的分配比率不是一个常数，因此宜采用全血进行测定。
全血（Whole blood）也应加入抗凝剂混合，防止凝血后影响测定。血样的采取量受到一定限制，特别是间隔比较短的多次取样，患者不易配合。过去一般取1～2ml。随着高灵敏度测定方法的建立，取量可减少到1ml以下。采取静脉血时，目前通行的方法是用注射器直接从静脉抽取，然后置试管中：采取毛细管取血时，应用毛细管或特殊的微量采血管采取。采取血样时，应由从事医疗工作的医生、护士或者临床检查技师实施，药剂师等不能进行采血工作。
血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异。例如：进行药物动力学参数的测定时，需给出药物在体内的药物浓度．时间曲线。应根据动力学曲线模型〈单室还是双室）、给药方式来确定取样间隔和次数，主要应在曲线首尾及峰值附近或浓度变化较大处取祥。采样次数示意图见
如进行治疗药物浓度监测（therapeuticdrug monitoring，TDM）时，则应在血中药物浓度达到稳态后才有意义。但每种药物的半衰期不同，因此达到稳态的时间也不间，取样时间也随之不同。药物进入体内后，大多数很快与血浆中的蛋白质（白蛋白、球蛋白）结合成结合型，并与未结合的游离型药物处于平衡状态而存在。结合型药物（bound型）不能通过血管壁，而游离型药物（free型）能够到达药物作用部位，因此可以说药物疗效与游离型药物浓度有着比较密切的关系，当然最理想的是测定游离型药物。由于测定游离型药物必须经过“超速离心”或“超滤法”等复杂的分离操作，又因药物的蛋白结合率没有很大的个体差异，通常血药总浓度（结合型与游离的总和）可以有效表示游离药物的浓度，因此，大多数的检验室不测定游离型药物，而是测定药物的总浓度。
但某些疾病可改变药物与血浆蛋白的结合率，如肝硬化病人奎尼丁的游离型药物分数几乎增加三倍；肾病时，苯妥英、水杨酸、安妥明等的血浆蛋白结合卒明显下降。有些药物血浆蛋白结合率存在着很大的个体差异，如奎尼丁的血浆蛋白结合率的范围为50％～90％，不同个体问游离药物浓度差达10倍。也就是说在肝硬化、肾功能不全、肾病变、低营养等状态下，血中白蛋白浓度显着减少，药物的蛋白结合率下降，游离型药物浓度上升，此时应测定游离型药物浓度。
采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。如不能立即测定时，应妥善储存。血浆或血清样品不经蒸发、浓缩，必须置硬质玻璃试管中完全密塞后保存。短期保存时置冰箱（4℃）中，长期保存时要在冷冻橱（库）（－20℃）中冷冻保存。
要注意采血后及时分离出血浆或血清再进行储存。若不预先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时引起细胞溶解从而妨碍血浆或血清的分离或因溶血影响药物浓度变化。
（二）唾液
唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的，平时所说的唾液就是指此混合液。一般成人每天分泌1～1.5ml，但个体差异大，即使是同－个人每日之内、每日之间也有变动；各腺体分泌的唾液组成也会有很大差别。对口腔粘膜给予机械的或化学的剌激时，会影响各唾液腺的分泌；视觉、听觉、嗅觉等剌激所产生的条件反射以及思维、情绪也会影响唾液腺的分泌；随年龄不同，唾液的分泌量也不同：小儿的唾液分泌量多，老年人的分泌量减少。
唾液的相对密度为1.003～1.008；pH值在6.2～7.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH值；通常得到的唾液含有粘蛋白，其粘度是水的1.9倍。
唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集。分泌量多的，可以将自然贮存于口腔内的唾液吐入试管中，1min内约可取1ml的唾液。必要时也可转动舌尖，以促进唾液的分泌。采集的时间至少要10min。采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。分层后，以3000rpm离心分离10min，取上清液作为药物浓度测定的样品。也可以采用物理的（如嚼石蜡块、橡胶、海绵）或化学的（如酒石酸）等方法剌激，使在短时间内得到大量的唾液。但另一方面，这样做往往使唾液中的药物浓度受到影响。特殊需要时，可以采集腮腺、颌下腺及舌下腺分泌的单一唾液。这种单一唾液的采集必须采用特殊的唾液采集器来收集。 ~6["b\}iY\
唾液中含有粘蛋白，唾液的粘度由粘蛋白的含量多少而定。粘蛋白是在唾液分泌后，受唾液中酶催化而生成的。为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在4℃以下保存。如果分析时没有影响，则可用碱处理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。唾液在保存过程中，会放出二氧化碳而使pH值升高，因此，需要测定唾液的pH值时，应在取样的当时为好。冷藏保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，不然测定结果会产生误差。
用唾液作为样品测定药物浓度有几个优点：与采取血样不同，患者自己可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集；采集时无痛苦无危险；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。但另一方面，由于唾液是由腮腺、颌下腺及舌下腺等各腺体分泌的组成不同的混合液体，其组成也会发生经时变动；因此，唾液中的药物浓度与血浆中的游离型药物浓度相比就容易变动；而且唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值〈S／P）只有少数药物是恒定值；有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比血浆浓度低得多，需要高灵敏度的分析方法才能检测；对有些患者（如癫痫、昏迷）不能采集唾液样品。最后应该指出的是：目前所指的血浆或血清浓度的治疗范围，都是指血浆或血清中的总浓度（游离型和结合型），因此，只有知道唾液中药物浓度与血浆中药物浓度有－定的比值时，唾液中药物浓度的监测才有意义，并且应该先求出具体患者的比值（S/P）。
（三）尿液
采用尿样测定药物浓度的目的与血液、唾液样品不同。尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究，并可推断患者是否违反医嘱用药，同时根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型（代谢速率，MR）等。
体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物（conjugete）等形式排出。尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，收集也方便。但尿液浓度通常变化很大。尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。
健康人排出的尿液是淡黄色或黄褐色的，成人一日排尿量为1~5L，尿液相对密度1.015~1.020，pH值在4.8~8.0之间。放置后会析出盐类，并有细菌繁殖、固体成分的崩解，因而使尿液变混浊。由于这些原因，必须加入防腐剂保存。采集的尿是自然排尿。尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。测定尿中药物浓度时应采用时间尿，时间尿以外的尿不可能推断全尿中药物的排泄浓度和药物总量。因此，测定尿中药物的总量时，将一定时间内（如8h、12h或24h等）排泄的尿液全部储在起来，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。如采集24h的尿液时，一般在上午8点让患者排尿并弃去不要，之后排出的尿液全部储存于干净的容器，中，直到次日上午8点再让患者排尿，并加入容器中。将此容器中盛的尿液做为检液。采集24h尿液时，常用2L容量的带盖的广口玻璃瓶，其体和可能会有士100ml的误差，因此，需再用量筒准确地测量储尿量。采集一定时间内的时间尿液时，常用涂蜡的一次性纸杯或用玻璃杯，并用量筒准确量好体积放入储尿瓶，并做好记录。
尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即P与血药浓度相关性差；受二试者的肾功能正常与否直接影响药物排泄，因而肾功能不良者不宜采用尿样；婴儿的排尿时间难于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。这些是尿样的缺点。
采集的尿样应立即测定。若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯、二甲苯、氯仿、麝香草酚以及醋酸、浓盐酸等。利用甲苯等可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改变尿液的酸碱性来抑制细菌的生长。保存时间为24～36h，可置冰箱（4℃）中，长时间保存时，应冰冻（－20℃）。
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5. 目前进行体内药物分析的方法有哪些何种方法是应用最多的方法为什么

目前进行体内药物分析的方法有哪些？何种方法是应用最多的方法？为什么
体内样品的预处理方法的选择需要综合考虑多种因素，包括体内样品的种类、被测药物的性质和浓度、以及所采用的测定方法等三方面。
如血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；尿液样品则常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出；唾液样品主要采用离心去除黏蛋白沉淀。
被测定药物的结构、性质、存在形式与浓度范围等，均直接影响到样品前处理方法的选择与应用。例如，药物的酸碱性（pKa）与溶解性影响到药物的萃取分离条件的选择，药物的极性、稳定性、官能团性质和光谱特性影响到其色谱测定条件的优化选择。不同药物在样品中的浓度相差悬殊，浓度大的样品对前处理要求稍低，浓度越低则样品前处理要求越高。