⑴ 药物分析方法中，有关物质主峰的保留时间多大合适
这个没有硬性要求，有关物质色谱条件优化以全部杂质达到分离，互相无干扰为前提。在有关物质中，供试溶液的主峰并不是主要考察范畴，各个杂质才是重点，只要主峰不影响杂质峰检测即可。
要注意一点，如果主峰保留时间较小，杂质峰在主峰后出峰，要注意主峰后首个杂质峰的定量情况。这些都需要方法学验证来证明。我做过的样品中，有关物质主峰最早有4分钟出峰的，有超过60分钟的，不一而足。
所以方法是否合适跟主峰保留时间没有必然联系，有关物质的主峰没有合适不合适的范围。
⑵ 分析物质成分有什么方法
分析物质成分方法：主成分分析是一种综合评价方法。它比较了样品的相对位置，比较了样品的优缺点，缺口和原因。方向不积极，没有正确的结论。因此，在分析中，必须转发指标体系中的强度逆指数和中等指数。
主成分分析的理论和计算较为成熟，但主成分分析的应用尚未达到解决实际问题的成熟状态。
根据总结，一些用户在应用主成分分析方法进行综合评价时有以下10个问题。
1、原始数据不正，有什么影响？如何转发？
2、原始变量是否意味着主成分的平方和不是1对？
3、主成分分析的主成分正交旋转后会发生什么？
4、回归计算是否需要主成分分析的主要成分？
5、主成分分析和正交因子分析吗？
6、何时进行主成分分析？
7、主成分分析有时会丢失一些原始变量的原因是什么？
8、如何命名主成分并维护原始变量和多个主成分之间的内在关系？
9、前m个主成分仍然是多因素，客观上只使用综合主成分进行综合分析？
10、综合评价结果，如何深入了解决策相关程度？
主成分分析服务范围
1、产品开发或改进：一般分析，比较分析，特殊需求分析。
2、质量控制：供应商评估，内部控制检查。
3、工业诊断：异物分析，失效分析，副产物分析。
4、了解成分:(溶剂，表面活性剂，树脂，主成分）定性和定量分析，名称
5、组分定量或验证，未知重复，无机定性定量，橡胶和塑料主成分表征等。
⑶ 如何建立HPLC法测定有关物质的方法
一、开始之前必须明白：
1、有关物质来源的两种途径：
1）合成过程中的中间体和副产物；
2）储存过程中产生的降解产物；
2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；
3、样品中可能含有的中间体；
4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；
二、准备工作
1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。
2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。
1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；
2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；
3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。
4）分析结构。。。。。。
5）与同类产品进行比较；
三、开工（以紫外检测为例）
1、流动相的选择（采用粗品进行选择）
1）、有文献，按文献进行优化。不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。
2）、没有文献。。。。。。
a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。要是有pda检测器就不需要这一步了。
b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。
2、最低检测限
3、系统适应性试验
重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告
4、考察中间体及副产物和样品的分离度。同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。
5、考察降解产物和样品的分离情况。
这个一般是通过破坏性试验来考察。常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。
6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。现在对三批样品进行测定，通过归一化来观察，应该可以知道杂质的大概情况，根据这个可以定出相应采用自身对照法测定的杂质限量。一般情况下还应定出最大的单一杂质限量。如果样品中的杂质可以很好得到纯品，那么你就可以采用外标法来准确定量。
7、杂质的限量必须根据你的样品本身性质来定。
⑷ 有关物质分析方法
物质由质量和大小、形状组成，物质是可以不变的，物质有固定的，专一的，
⑸ 物质分析的方法通常有
四、工业分析方法
1、按照方法原理：
化学分析法：以物质的化学反应为基础的分析方法称为化学分析法。化学分析历史悠久，是分析化学的基础，所以又称为经典化学分析法。主要的化学分析方法有两种：
(1)重量分析法；
(2)滴定分析法(容量分析法)。
物理和物理化学分析法：以物质的物理和物理化学性质为基础的分析方法。
由于这类方法都需要较特殊的仪器，故一般又称为仪器分析法。仪器分析法有光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、质谱分析法和放射化学分析法等。在钢铁冶金分析中常用的仪器分析(1)分光光度法(比色法)；(2)原子吸收分光光度法：(3)发射光谱分析；(4)x射线荧光光谱分析。
2、按照分析任务：
定性分析：定性分析的任务是鉴定物质是由哪些元素或化合物所组成的
定量分析：定量分析的任务则是测定物质中有关组成的含量。钢铁冶金实验中最常用的是定量分析。结构分析：
表面分析：对固体表面或界面上只有几个原子层厚的薄层进行组分、结构和能态等分析的材料物理试验。也是一种利用分析手段，揭示材料及其制品的表面形貌、成分、结构或状态的技术。主要在机械工业中主要用于金属材料的氧化、腐蚀、摩擦、磨损和润滑特性等的研究和合金元素及杂质元素的扩散或偏析、表面处理工艺及复合材料的粘结性等问题的研究。
形态分析是研究结构或形状的。
3、按照分析对象:无机分析、有机分析
4、按照试剂用量
常量分析，半微量分析和微量分析
根据试样的用量及操作方法不同，可分为常量、半微量和微量分析。各种分析操作时的试样用量如表7—l所示。在无机定性化学分析中，一般采用半微量操作法，而在经典定量化学分析中，一般采用常量操作法。
另外，根据被测组分的质量分数，通常又粗略分为常量(大于1％)、微量(0．01％~1％)和痕量(小于0．01％)成分的分析。
5、按照分析要求：
例行分析和仲裁分析
例行分析是指一般化验室日常生产中的分析，又叫常规分析
仲裁分析是不同单位对分析结果有争议时，要求有关单位用指定的方法进行准确的分析，以判断分析结果的准确性。在仲裁分析时，准确度是主要矛盾。
6、按照分析时间及所起作用
快速分析：快速分析是例行分析的一种，主要用于生产过程的控制。例如炼钢厂的炉前快速分析，要求在尽量短的时间内报出结果，分析误差一般允许较大。
标准分析：
7、分析测试程序：
离线分析;
在线分析
SiC粉体在硫酸铝-硫酸钠复合熔盐中反应转化
的研究
⑹ 化学分析中有关物质怎么做
要根据具体物质，选用具体的分析方法。
⑺ “未知杂质”怎么进行有关物质测定方法验证
杂质检查，其中，而后者重点要求验证专属性，由于方法本身原因。为达到控制质量的目的。方法验证是物研究过程中的重要内容、杂质检查 作为纯度检查。 3，均需要进行方法验证、可靠。或将供试品用强光照射，进行色谱峰纯度检查，测试方法适用的试样中被分析物高低限浓度或量的区间、定量限等涉及定量测定的项目，高湿。 在杂质可获得的情况下。 一定的准确度为定量测定的必要条件，而非其它物质，则应为下限的-20％至上限的+20％、杂质 杂质测定时、质量可控是品研发和评价应遵循的基本原则，对于制剂一般以回收率试验来进行验证，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，并具适当的准确度与精密度。此外，并成为质量研究和质量控制的组成部分，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量、杂质定量试验 杂质的定量试验可向原料或制剂中加入已知量杂质进行测定，如有关物质，响应信号可经数学转换。例如、含量测定 含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果、有机溶剂等，而对于精密度，也就是说要对物进行多个项目测试，以充分表明分析方法符合测试项目的要求，如典方法或经过验证的方法。 六，这就是通常所说的对方法进行验证，比较测定结果。 专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。 （二）方法验证的整体性和系统性 方法验证内容之间相互关联。 2，不提倡教条地去进行方法验证，用面积归一化法、定量限、释放度等）、含量测定方法中均应考察其专属性，各测定3次，检测结果与供试品中被分析物的浓度（量）直接呈线性关系的程度，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求、标准偏差或相对标准偏差表示、中间精密度 中间精密度系指在同一实验室，对品进行质量控制是保证品安全有效的基础和前提，则线性范围应为杂质规定限度的-20％至含量限度（或上限）的+20％、方法验证的具体内容 （一）专属性 专属性系指在其他成分（如杂质。 （六）检测限 检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，验证过程应规范严谨、 杂质检查 定量测定（含量测定。 在杂质或降解产物不能获得的情况下，则一般不需要进行验证。 从本质上讲。 并非每个检测项目的分析方法都需进行所有内容的验证，则一般认为整个检测方法也具有较强的专属性、合理，对于这些项目的分析方法验证应有不同的要求，范围应为限度的±20％。 用于定量试验的分析方法验证强调专属性，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，可在线测定杂质的相关数据。 在杂质可获得的情况下，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果、旋光度，考察测定结果是否受干扰，比较破坏前后检出的杂质个数和量，则验证范围应为0～110％，高温，或100％的浓度水平、溶出度或释放度，专属性可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、碱水解及氧化），但不一定要准确定量，或分别精密称样，方法验证内容的选择和试验设计方案应系统。 如不能测得杂质的相对响应因子、重复性 重复性系指在同样的操作条件下、含量测定 范围应为测试浓度的80％～100％或更宽，按照相应的测定方法进行试验、溶出度。 1，如有机杂质，应采用多个方法予以补充，各测定3次、杂质定量试验等，用两种方法进行含量测定。 （二）线性 线性系指在设计的测定范围内。 线性是定量测定的基础，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较，涉及定量测定的项目。准确度应在规定的范围内建立，此时采用两种或两种以上分析方法可加强鉴别项目的整体专属性，采用的分析方法能够正确鉴定。 必要时。 通常，是否能有效控制品的内在质量，必要时，在较短时间间隔内。 杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质。 对于释放度，在方法验证过程中，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料、多层面来控制品质量，由于实际情况较复杂，经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度（离散程度）、有效。试验设计需考虑在规定范围内，再进行线性回归计算，当杂质的光谱与主成分的光谱相似，由于这些检测项目的要求与鉴别、生物活性等。 总之。 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学。 只有经过验证的分析方法才能用于控制品质量、准确性和可行性进行验证。 二，由于此类项目对准确性要求较高，对比两种方法测定的结果，需要多角度，方法验证均注重整体性和系统性。 可以采用符合要求的原料配制成不同的浓度、线性、杂质定量试验等。有时也称真实度。因此不论从研发角度还是评价角度。 范围应根据剂型和（或）检测项目的要求确定，得到含有杂质或降解产物的试样。如采用的方法不够专属，即测定9次，如规定限度范围为，但假如在杂质检测时采用了专属性较强的色谱法、重现性 指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。 该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力、测定结果的精密度、准确度和线性，制备一系列被测物质浓度系列进行测定、方法验证涉及的三个主要方面 （一）需要验证的检测项目 鉴别。 3、生物活性等） 鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，每一测试项目可选用不同的分析方法。如杂质限度试验一般需要验证专属性和检测限、分子量分布。 2，结合所采用分析方法的特点确定。取样测定次数应至少6次。 验证设计方案中的变动因素一般为日期，由同一分析人员测定所得结果的精密度。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性，同一测试方法可用于不同的检测项目、重金属。在方法验证内容之间也存在较多的关联性，专属性略差。 （四）准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度，如含量测定。 分析方法原理 仪器及仪器参数 试剂 系统适用性试验 供试品溶液制备 对照品溶液制备 测定 计算及测试结果的报告等 测试方法 化学分析方法 仪器分析方法 这些方法各有特点，报告已知加入量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其可信限，方法验证就是根据检测项目的要求，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法验证。 4。 同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求、辅料等）可能存在下，需确证含被分析物的供试品呈正反应，从1小时后为20％至24小时后为90％。用于限度试验的分析方法验证侧重专属性和检测限，制备3个不同浓度的试样、检出被分析物质的特性。并应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％）或面积比（％）。 1、设备，由于实验室内部条件改变、准确度、制剂的溶出度测定等。 2、含量测定 原料可用已知纯度的对照品或符合要求的原料进行测定，如杂质定量试验和含量测定均需要验证线性。 （五）精密度 精密度系指在规定的测试条件下，如制备3个不同浓度的试样，必须对所采用的分析方法的科学性。 2，方法验证应围绕验证目的和一般原则来进行，观察是否呈线性。 方法验证的内容应根据检测项目的要求，可向供试品中加入一定量的杂质，高湿、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定、分析人员。因此对杂质限度试验，需证明方法具有足够低的检测限、合理，对于鉴别项目所需要的专属性，用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性，如含量测定、准确度和定量限： 重复性 中间精密度 重现性 1。如原料含量测定采用容量分析法时，来全面考察品质量。 例如，并说明依据，可以相互补充。杂质检查可分为限度试验和定量试验两种情况。 定量测定包括含量测定，则可采用原料的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）、仪器设备，用至少测定6次的结果进行评价： 方法的专属性 线性 范围 准确度 精密度 检测限 定量限 耐用性 系统适用性等 四，为使测试结果准确。根据剂型特点，故所采用的分析方法要求具有一定的专属性，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定。 1、对方法验证的评价 （一）有关方法验证评价的一般考虑 总体上、 其他特定检测项目 （分子量及分子量分布。 方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用。 必要时进行色谱峰纯度检查。 （二）分析方法 分析方法是为完成上述各检测项目而设定和建立的测试方法。 制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定，范围应根据初步实测结果、溶出度或释放度 对于溶出度，一般一种分析方法不太可能完全鉴别被分析物，证明杂质与共存物质能得到分离和检出，高温，如时间，但验证内容可不相 （三）验证内容 验证内容。 范围是规定值、杂质检查、鉴别反应 鉴别试验应确证被分析物符合其特征，至少制备5个浓度，必要时，鉴别、制剂含量均匀度 范围应为测试浓度的70％～130％。 重复性测定可在规定范围内、含量均匀度、喷雾剂，以保证检出需控制的杂质。涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证；如规定限度范围。如果不能得到杂质。 精密度一般用偏差，而不含被测成分的阴性对照呈负反应、碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影响），是一个整体，应进行重现性试验，足以证明采用的分析方法的合理性。 在杂质或降解产物不能获得的情况下，与另一个已建立准确度的方法比较结果。 应在设计的测定范围内测定线性关系，因此方法验证是制订质量标准的基础。 也可采用破坏性试验（强光照射。 精密度可以从三个层次考察、方法验证的一般原则 原则上每个检测项目采用的分析方法。 3、降解物，但同时也要注意验证内容应充分。 范围通常用与分析方法的测试结果相同的单位（如百分浓度）表达，酸。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，至少用9次测定结果进行评价，用最小二乘法进行线性回归，范围可适当放宽，预先设置一定的验证内容。一般地。可用一贮备液经精密稀释，如气雾剂。 当分析方法将被法定标准采用时、分析人员。 （三）范围 范围系指能够达到一定的准确度、无机杂质等。如果含量测定与杂质检查同时测定，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，同一均质供试品，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，在试验研究开始前应确定验证的范围和试验方法，前者重点要求验证专属性。 三化学物质量控制分析方法验证技术指导原则 一。 其他特定检测项目包括粒径分布、精密度和线性、定量测定等有所不同，对于这些方法如何进行验证需要具体情况具体分析，拟订出规定限度的±20％，越来越多的新方法不断被用于质量控制中，而不能照搬指导原则，可采用另一个经验证了的或典方法进行比较，酸、概述 保证品安全。如不能得到制剂的全部组分
⑻ 有关物质方法学重复性和回收率有什么区别
在环境样品分析中，常采用测定加标回收率的方法检验某一分析方法对样品分析的适应性和方法的系统误差，判断样品中是否有干扰物存在．确定分析结果的准确度等．在开常分折中也把加标回收率测定作为分析质量控制的一种重要手段。。
⑼ 如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法
摘要 本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。
关键词 薄层色谱法（TLC法） 有关物质 方法建立
有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在药品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。
TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。
1．测定方法类型
常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。
2．展开剂的确定（即专属性试验）
专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来
验证系统适用性。之所以如此配制，目的是模仿样品中有可能存在的状态，即有少量（1%左右）杂质存在时是否能与主成分达到完全分离，只有这样才能比较客观、科学地反映样品中实际存在情况的（见图1）；而不应把该溶液配制成：主成分与中间体相同浓度的。因为一者实际检测时样品中不可能存在此种情况；二者该浓度不易确定，目前国内申报资料中一般的作法均是配制成较低的一致浓度，这样各斑点当然易于完全分离了（见图2），但在实际测定时，由于主斑点急剧增大，很易将相邻杂质包含于主成分斑点中。同样，质量标准中的系统适用性试验用溶液的配制方法亦如此。
（1，3，4为杂质，2为主成分）
图1 图2 （杂质浓度均为供试品溶液浓度的1%）
3．检出条件的确定
其基本出发点是：主成分与相关杂质均应在该条件下显色，且在相同浓度下，斑点大小应基本一致。薄层板的类型根据被测物质的性质来选用，测定有紫外吸收的物质通常选用GF254或GF365板；测定无紫外吸收、需喷显色剂的，常选用硅胶G板或H板，选用该类薄层板时，显色方法根据被测物质的结构式选取，但当有多个显色方法时，应分别进行试验，选取灵敏度最高的显色方法。如醋酸氢化可的松有关物质的测定，中国药典2000年版采用碱性四氮唑蓝试液显色，美国药典26版采用硫酸-乙醇(10:90)溶液显色，两者均为激素类药物的显色方法。醋酸氢化可的松属于激素类中的肾上腺皮质激素，四氮唑法是肾上腺皮质激素的重要显色方法；而硫酸-乙醇显色法则主要是针对激素类中的雌激素的显色反应，对于属于肾上腺皮质激素类的醋酸氢化可的松则反应活性不强，结果两法的灵敏度相差10倍以上。因此，检出条件的确定，一定要在查阅文献的基础上，并根据试验结果进行综合考虑。
4．供试品溶液浓度的确定（灵敏度试验——最低检出限的测定）
供试品溶液浓度的设定在有关物质检测中是至关重要的，浓度越高、越能反映样品中杂质存在的情况，但若设定得过高，则会产生主斑点严重拖尾、“断腰”等超载现象的发生，产生错误结论；若设定太低，又将达不到检测杂质的目的，观测不到杂质量的变化。其设定是根据最低点样量和最大点样量来综合考虑的。
最低检出限虽然是个绝对值，但真正的意义却是其相对值，即相对于供试品溶液的浓度多少而言，所以测定结果不仅要罗列出其绝对值又应列出其相对值，这样最低检出限才有意义！最大点样量则是通过不断加大供试品溶液浓度，直至主斑点严重拖尾、“断腰”等情况出现时来得到的。然后根据最低检出限，采用“上推法”来确定：如一般设定杂质斑点小于1.0%对照斑点，对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度（即最低检出限）的20~50倍，则供试品溶液浓度是最低检出浓度的2000~5000倍；反过来，最低检出浓度应至少达到供试品溶液浓度的0.02%~0.05%。应注意的是：由于最低检出量和最大点样量因试验环境、薄层板质量以及即时试验时其他各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证小于最大进样量的情况下，可在此基础上设定得再高一些，以保证该浓度可适用于各种条件下。举例说明见表1（规定杂质限度为1.0%）。
表1 最低检出量、最大点样量、供试品溶液和对照溶液浓度之间的比例关系
最大点样量
供试品溶液
对照溶液
最低检出量 浓 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 点样量 10μl 10μl 10μl 10μl 绝对量 30μg 0.3μg 10ng 相对于样品测定浓度的 100% 1.0% 0.02% 倍 数 关 系 5000倍 30倍 “基准点”
供试品溶液浓度也可设定得再高些，但不可超过最大点样量。
5．加样回收试验（即准确性试验）
准确性试验可采用在预经有关物质测定后的样品中，加入已知量杂质的方法来评价。准确称取各杂质，将含有1%(w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的薄层测定条件是否可分离检测出相应的各杂质以及样品中已存在的杂质是否累加，斑点是否加深。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。
6．强力破坏试验
该项研究是为了揭示原料药内在稳定性的特性，它是开发研究的一部分。这些试验是在比加速试验更剧烈的条件下进行的，其能够包含药品在销售过程中所遇到的剧烈条件。可取一批样品通过强光、高温、高湿、氧化破坏、以及酸碱破坏来证明该展开条件能分离检测出杂质。
7．展开距离
测定时一定要采用25cm、长薄层板，展开距离应尽可能长一些，以使杂质与主成分尽量分离。如用短板，易造成临近主斑点的杂质斑点“躲进”主斑点中。但同时又应注意，距离拉大，斑点分散，会损失最低检出限，降低灵敏度，故应综合考虑。
8．其它的因素
展开温度应尽量控制在20~25℃之间，尤其在冬季，应注意环境的温度，如太低，将严重影响展开效果。另层析缸的盖儿，应涂抹凡士林油，以保证整个试验过程中，层析缸的密封，避免展开剂挥发；并应在展开前，预先倾入展开剂，以使层析缸内的空气饱和，达到最佳的展开效果。薄层板由于有自制、市售，质量不一也应注意。
二．讨论
1． 质量标准中的系统适用性试验，最好能将最难分离的杂质订入系统适用性试验用溶液的配制，将此杂质的浓度配制为主成分浓度的1%，或0.5%，或0.2%（依据杂质限度而定）进行试验，验证分离度后，再进行样品的测定，以确保试验的准确进行。
2． 质量标准中，应配制系列浓度的对照溶液（即梯度对照），以对杂质有“半定量”的概念，这可更好地评价杂质存在的情况；并应规定杂质的个数及最大杂质斑点的限度，使质量标准更完善、科学。经查阅，中国药典薄层色谱法测定有关物质的有70个品种，仅有2个品种采用了梯度对照，绝大部分品种仅是制定了对照溶液，均未规定杂质个数，和最大杂质斑点限度，如有若干个杂质斑点也无法判定；而英国药典和美国药典则几乎每个品种均采用梯度对照，并规定杂质个数和最大杂质斑点限度，这一点值得学习和推广。
3． 错误的一种误区，认为HPLC法完全替代了TLC法，这是不正确的，一定要做到相互补充、相互论证、相互参考才是最客观、最科学的！
本文是在参阅了日本《分析方法验证》一书和大量日本国内新药申报资料中质量研究部
分的内容所写而成。
⑽ 如何建立HPLC法测定有关物质的方法.ppt
摘要 本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。
关键词 薄层色谱法（TLC法） 有关物质 方法建立
有关物质是研究品中除主成分以外的杂质，它可能是原料合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。
TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。
1．测定方法类型
常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。
2．展开剂的确定（即专属性试验）
专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来
验证系统适用性。之所以如此配制，目的是模仿样品中有可能存在的状态，即有少量（1%左右）杂质存在时是否能与主成分达到完全分离，只有这样才能比较客观、科学地反映样品中实际存在情况的（见图1）；而不应把该溶液配制成：主成分与中间体相同浓度的。因为一者实际检测时样品中不可能存在此种情况；二者该浓度不易确定，目前国内申报资料中一般的作法均是配制成较低的一致浓度，这样各斑点当然易于完全分离了（见图2），但在实际测定时，由于主斑点急剧增大，很易将相邻杂质包含于主成分斑点中。同样，质量标准中的系统适用性试验用溶液的配制方法亦如此。
（1，3，4为杂质，2为主成分）
图1 图2 （杂质浓度均为供试品溶液浓度的1%）
3．检出条件的确定
其基本出发点是：主成分与相关杂质均应在该条件下显色，且在相同浓度下，斑点大小应基本一致。薄层板的类型根据被测物质的性质来选用，测定有紫外吸收的物质通常选用GF254或GF365板；测定无紫外吸收、需喷显色剂的，常选用硅胶G板或H板，选用该类薄层板时，显色方法根据被测物质的结构式选取，但当有多个显色方法时，应分别进行试验，选取灵敏度最高的显色方法。如醋酸氢化可的松有关物质的测定，中国典2000年版采用碱性四氮唑蓝试液显色，美国典26版采用硫酸-乙醇(10:90)溶液显色，两者均为激素类物的显色方法。醋酸氢化可的松属于激素类中的肾上腺皮质激素，四氮唑法是肾上腺皮质激素的重要显色方法；而硫酸-乙醇显色法则主要是针对激素类中的的显色反应，对于属于肾上腺皮质激素类的醋酸氢化可的松则反应活性不强，结果两法的灵敏度相差10倍以上。因此，检出条件的确定，一定要在查阅文献的基础上，并根据试验结果进行综合考虑。
4．供试品溶液浓度的确定（灵敏度试验——最低检出限的测定）
供试品溶液浓度的设定在有关物质检测中是至关重要的，浓度越高、越能反映样品中杂质存在的情况，但若设定得过高，则会产生主斑点严重拖尾、“断腰”等超载现象的发生，产生错误结论；若设定太低，又将达不到检测杂质的目的，观测不到杂质量的变化。其设定是根据最低点样量和最大点样量来综合考虑的。
最低检出限虽然是个绝对值，但真正的意义却是其相对值，即相对于供试品溶液的浓度多少而言，所以测定结果不仅要罗列出其绝对值又应列出其相对值，这样最低检出限才有意义！最大点样量则是通过不断加大供试品溶液浓度，直至主斑点严重拖尾、“断腰”等情况出现时来得到的。然后根据最低检出限，采用“上推法”来确定：如一般设定杂质斑点小于1.0%对照斑点，对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度（即最低检出限）的20~50倍，则供试品溶液浓度是最低检出浓度的2000~5000倍；反过来，最低检出浓度应至少达到供试品溶液浓度的0.02%~0.05%。应注意的是：由于最低检出量和最大点样量因试验环境、薄层板质量以及即时试验时其他各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证小于最大进样量的情况下，可在此基础上设定得再高一些，以保证该浓度可适用于各种条件下。举例说明见表1（规定杂质限度为1.0%）。
表1 最低检出量、最大点样量、供试品溶液和对照溶液浓度之间的比例关系
最大点样量
供试品溶液
对照溶液
最低检出量 浓 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 点样量 10μl 10μl 10μl 10μl 绝对量 30μg 0.3μg 10ng 相对于样品测定浓度的 100% 1.0% 0.02% 倍 数 关 系 5000倍 30倍 “基准点”
供试品溶液浓度也可设定得再高些，但不可超过最大点样量。
5．加样回收试验（即准确性试验）
准确性试验可采用在预经有关物质测定后的样品中，加入已知量杂质的方法来评价。准确称取各杂质，将含有1%(w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的薄层测定条件是否可分离检测出相应的各杂质以及样品中已存在的杂质是否累加，斑点是否加深。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。
6．强力破坏试验
该项研究是为了揭示原料内在稳定性的特性，它是开发研究的一部分。这些试验是在比加速试验更剧烈的条件下进行的，其能够包含品在销售过程中所遇到的剧烈条件。可取一批样品通过强光、高温、高湿、氧化破坏、以及酸碱破坏来证明该展开条件能分离检测出杂质。
7．展开距离
测定时一定要采用25cm、长薄层板，展开距离应尽可能长一些，以使杂质与主成分尽量分离。如用短板，易造成临近主斑点的杂质斑点“躲进”主斑点中。但同时又应注意，距离拉大，斑点分散，会损失最低检出限，降低灵敏度，故应综合考虑。
8．其它的因素
展开温度应尽量控制在20~25℃之间，尤其在冬季，应注意环境的温度，如太低，将严重影响展开效果。另层析缸的盖儿，应涂抹凡士林油，以保证整个试验过程中，层析缸的密封，避免展开剂挥发；并应在展开前，预先倾入展开剂，以使层析缸内的空气饱和，达到最佳的展开效果。薄层板由于有自制、市售，质量不一也应注意。
二．讨论
1． 质量标准中的系统适用性试验，最好能将最难分离的杂质订入系统适用性试验用溶液的配制，将此杂质的浓度配制为主成分浓度的1%，或0.5%，或0.2%（依据杂质限度而定）进行试验，验证分离度后，再进行样品的测定，以确保试验的准确进行。
2． 质量标准中，应配制系列浓度的对照溶液（即梯度对照），以对杂质有“半定量”的概念，这可更好地评价杂质存在的情况；并应规定杂质的个数及最大杂质斑点的限度，使质量标准更完善、科学。经查阅，中国典薄层色谱法测定有关物质的有70个品种，仅有2个品种采用了梯度对照，绝大部分品种仅是制定了对照溶液，均未规定杂质个数，和最大杂质斑点限度，如有若干个杂质斑点也无法判定；而英国典和美国典则几乎每个品种均采用梯度对照，并规定杂质个数和最大杂质斑点限度，这一点值得学习和推广。
3． 错误的一种误区，认为HPLC法完全替代了TLC法，这是不正确的，一定要做到相互补充、相互论证、相互参考才是最客观、最科学的！
本文是在参阅了日本《分析方法验证》一书和大量日本国内新申报资料中质量研究部
分的内容所写而成。