‘壹’ 怎么使用多功能酶标仪检测双荧光素酶报告基因
以Promega公司双荧光素酶检测试剂盒为例：
1. 试剂准备
按照说明书配制PLB细胞裂解液、LAR II检测液、Stop&Glo检测液。
2.仪器准备
准备单管或微孔板发光检测仪
3. 样品准备
按照说明书使用PLB细胞裂解液裂解细胞，取20ul细胞裂解液
4. 检测过程
a) 在1.5ml离心管中加入20ul细胞裂解液，然后加入100ul的LARII溶液，混合后放入发光检测仪检测第一次发光值；
b) 然后加入Stop&Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入发光检测仪检测第二次发光值。
‘贰’ 酶标仪原理_酶标仪使用说明
酶标仪的检测原理
光是电磁波，波长100nm～400nm称为紫外光， 400nm～780nm之间的光可被人眼观察到，大于780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。
检测单位：
光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
检测单位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD＝1og（1／trans），其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系：
E＝OD=logΙ0/Ι其中E表示被吸收的光密度， Ι0 为在检测物之前的光强度，Ι为从被检测物出来的光强度。
OD值由下述公式计算：
E＝OD=C×D×E
C为检测物的浓度
D为检测物的厚度
E为摩尔因子
在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。
但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。
Anthos 酶标仪检测值计算
仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量，转换成二进位数字信号，最大为4095。仪器定义没有光源下的透光值为 0％，没有检测物的透光值为100％。则实际检测中，检测物的透光值均在 0％一100％之间。透光值
的计算如下：
T＝（Meas—Min）／（Max—Min）
其中T为透光值， Meas为检测的二进位数值， Min为在 0％的情况下检测的二进位数值， Max为在100％的情况下检测的二进位数值，举例如下：
MaX=3600 Mn=20 Meas＝30
T=（30-20）/3600-20)＝0．0028
OD＝1og（1/T）=1og（1/0.0028）=2.552
Anthos 酶标仪的中心定位
仪器会自动对酶标孔进行中心定位，中心定位是要消除酶标孔底的凸凹引起的厚薄不均伍茄差带来检测的不准确。在对每一个酶标仪进行检测时，仪器其实要进行35个点的测量，选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。
光源的参照通道
参照通道是用来校准由于电压不稳或灯泡磨损带来的影响。
酶标仪的用途和其它提示
用于ELISA试剂的测定，广泛用于各种实验室，包括临床实验室。
质量控制
质量控制是试剂检测的重要因素。请按照试剂说明书的要求进行质量控制腔皮。 空白校正
有一些试剂盒的说阴书将空白孔设置为空气，其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的，请按照试剂盒的说明书要求进行。
检测结果的解释
由于有相当多的因素会影响检测的结果，如不同的酶标板，检测试剂的体积，都会造成OD值的不，因此，只有使用同一酶标板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解释请依照试剂盒的说明书进行。
酶标仪的使用注意事项
1、工作环境
酶标仪是一种精密的光学仪器，因此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。根据DIN VDE 0871条例，仪器应放置在无磁场和干扰电压的位置。依据DIN 45 635 －19条例：
仪器应放置在低于40分贝的环境下。
为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。
操作时环境温度应在15℃－40℃之间，环境湿度在15％－85％之间。
操作电压应保持稳定。
操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。
保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。
2、操作注意事项
酶标仪的功能是用来读取酶联免疫试剂盒的反应结果，因此要得到准确结果，试剂盒的使用必须规范。许多医院在使用酶标仪之前是通过目测判断结果，操作过程随意性较大，在使用酶标仪后如果不能及时纠正操作习惯，会造成较大误差。在酶标仪的操作中应注意以下事项：
使用加液器加液，加液头不能混用。
洗板要洗纳高干净。如果条件允许，使用洗板机洗板，避免交叉污染。
严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。
在测量过程中，请勿碰酶标板，以防酶标板传送时挤伤操作人员的手。
请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完成后请洗手。
如果使用的样品或试剂具有污染性、毒性和生物学危害，请严格按照试
剂盒的操作说明，以防对操作人员造成损害。
如果仪器接触过污染性或传染性物品，请进行清洗和消毒。
不要在测量过程中关闭电源。
对于因试剂盒问题造成的测量结果的偏差，应根据实际情况及时修改参数，以达到最佳效果。
使用后盖好防尘罩。
出现技术故障时应及时与厂家联系，切勿擅自拆卸酶标仪。
酶标仪及洗板机选购指南
酶标仪（Microplate Reader）是对酶联免疫检测（ EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显示，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中待测抗体或抗原的浓度。 酶标仪广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中，特别在近
几年中，由于大量的酶联免疫检测试剂盒的应用，使得酶标仪在生殖保健领域中应用越来越广泛，同时促进了生殖健康技术水平提高 。
目前国内许多计生站系统开展了酶免检测项目，如：乙肝五项、爱滋病检测、优生优 育系列检测、激素检测等。过去多数采用目测方法，报出的结果缺乏科学的依据。例如：某弓形虫检测试剂盒中，临界值规定为：阴性对照品的 OD 值×2.5，通过目测无法判断标本孔的反应颜色是否超过临界值。肉眼进行两孔之间的颜色比较可能还行，但比较一孔的颜色是否超过另一孔颜色的2.5倍就不可能。
国内多家权威机构，如卫生部临床检验中心和计划生育系统等多次强调酶标仪的重要性，并要求酶联免疫检测试剂应使用酶标仪判读，酶免试剂的质控也应使用酶标仪，并提供酶标仪测定的原始数据，而各厂家的试剂盒说明书没有是让用目测的。同时酶免检测的 项目往往是一些实质性的感染和病变（如：肝炎、爱滋病、优生优育等），判读更要求严谨，由误诊引起的纠纷很难处理。另外，住院手术病人术前的丙肝、爱滋等 EIA 试剂检测是避免因输血引起感染引发的医疗事故纠纷的必要手段，正逐渐被许多单位所采用。
我国免疫诊断方法主要有如下三种：酶免（EIA）、放免（RIA）和发光，在市场上的情况如下：
方法 所处市场周期
放免 衰退期
酶免 成长期
发光 进入期
放免技术由于试剂的污染和有效期等问题在国际和国内市场逐渐被淘汰，而化学发光试剂和设备比较昂贵，使得其在国内的普及特别在计生系统普及需要较长时间，EIA 技术稳定，试剂价格合理，供应充，酶免技术在中国市场处于成长期，因此购买酶标仪正合适宜。 尤其要提到的是，在中国的计划生育和妇幼保健系统配备酶标仪已经迫在眉睫。早在几年以前, 世界卫生组织已建议对孕妇进行 TORCH五项常规筛查，但是遗憾的是由于缺乏酶标仪和洗板机等设备，RCH的检测在中国还未能普遍开展。TORCH 感染在围产医学中称为TORCH综合症，由于孕妇, 胎儿和新生儿都易被感染, 它已受到全世界妇产科和儿科的极大重视。妊娠期感染不仅危害母体，往往还可对胎儿和新生儿产生严重影响。通过胎盘可引起子宫内感染而导致流产、早产、死胎或胎儿生长迟缓和畸形，通过产道和母乳可引起新生儿感染。如累及神经系统可造成不同程度的智力障碍以及各种瘫痪、失聪、失明等严重后遗症，影响人口素质，因而 TORCH 感染与优生优育有极为重要的关系。因此，RCH（IgG和gM）检查通常也称为优生优育十项检查。目前，TORCH的检测方法主要有放免（RIA）和酶免(EIA)。由于放免方法需要特殊仪器，且有放射危害，目前正被酶免（EIA）方法取代。EIA方法具有特异性强，灵敏度高，简单快速，成本低等优点，只要配备有酶标仪和其他相应的设备 ，多数普通实验室均可方便地开展 。 很显然, 尽快在计生系统普及酶标仪等设备是一个迫切的需求。
这项工作的落实将有助于提高诊治水平，降低母婴发病率，从而提高整个国民的健康素质。目前市场上提供的EIA试剂越来越多，如：T3、T4、TSH、TORCH 系列、不孕系列、各种癌症标志物、伤寒、副伤寒等，另外通过母婴传播的性传播疾病(如淋病、梅毒、HIV)和肝炎（如HBV、HCV)，以及胎儿的抗体，新生儿TSH的测定，疫苗反应等，市场上也都有成套 EIA 试剂盒供应。使用酶标仪有利于拓展检测项目，提高检测水平，其社会效益和 经济效益并举。
酶标仪单、双波长检测的比较
发布时间04年05月10日 13时59分
邹荣良
在用酶联免疫法测定抗原或抗体时，不论是定量试验还是定性试验都要求使用酶标仪进行测定。一般的酶标仪在测定中均有单波长和双波长的模式，并且采用的都是垂直光路。但在日常工作中有时会不太重视单波长和双波长的选择，对使用单、双波长给测定结果带来的较大差异也不很了解，并且实际工作中也出现了使用单波长检测导致抗HCV部分弱阳性的漏检。因此，本人就酶标仪在选择单、双波长使用方面谈谈个人的体会，供同道参考。
一 材料和方法
1.材料 由上海科华公司提供的乙肝表面抗原测定试剂盒；eppendorf 20-20ul的移液器。
2.仪器 上海科华公司的ST-360酶标仪和BIO-RAD 550酶标仪。
3.方法 底物液配制：底物液A、B各5ml混合，加入微量酶标记物，再加入5ml终止液，呈微黄色，混匀待用；利用上海科华公司提供的乙肝表面抗原试剂盒的酶标板，用94孔中准确加入150ul配制好的上述底物液，另2孔中加入150ul已终止的空白底物液作空白。在BIO-RAD 550酶标仪上分别进行450nm单波长和450nm及655nm（无630nm）的双波长检测，在ST-360上分别进行450nm单波长和450nm及630nm的双波长检测吸光度各两次。
二 结果
1.分别对所得结果进行统计，发现单、双波长测定结果有较大的差异，双波长测定结果的CV值远小于单波长测定，结果见表1。
2.对ST-360两次重复测定结果进行分析，结果基本一致，见表2。
表1 酶标板吸光度在两台酶标仪上的测定统计结果
表2 ST-360酶标仪两次吸光度测定统计结果
三 讨论
1.酶标仪与分光光度计、自动生化分析仪等的吸光度测定有所不同，一般分光光度计是水平光路，而酶标仪则是垂直光路，但测定原理相同，都是使用朗伯-比耳定律，测定的都是样本的吸光度。垂直光的特点是标本吸光度受液体浓缩或稀释的影响小，不足之处是受被测样本液面是否水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的影响较大。
2.酶标仪在用单波长测定吸光度时，除受到测定干扰（样本的浊度、干扰色等）和电路干扰（包括噪音、漂移、电压等）等因素外，受液体表面张力的影响也很大。在检测过程中，由于液体表面张力的作用，液体的表面不是一个平面，而是形成一个凹面，从侧面看似凹透镜，这样不可避免会影响光路的正常通过。由于凹液面的影响，光线在通过液体时，除正常被液体吸收一部分外，尚有部分被折射和反射（如光线通过凹透镜那样），影响吸光度的检测。而酶标仪使用的又是通过光导纤维传播的点光源，如果每次能在同一部位检测，吸光度的重复性将得到保证，但由于机械运动等造成的误差，不可能保证每孔都在相同部位被检测，因此造成了孔与孔之间有一定的差异。结果见表1，整块板单波长检测的CV在3%以上，吸光度最高值和最低值的相对误差达17%以上。
3.在双波长测定中，减少了测定干扰和电路干扰，因此测定结果明显好转，结果见表1，整块板样本的CV在2%以下。ST-360在进行稳定性观察中，如表2所示，两次检测结果基本一致，这表明ST-360的稳定性较好。同时，从表1也可以看到，科华公司生产的ST-360与BIO-RAD 550的检测结果一致，两者的检测性能基本相同。
4.由于液体表面张力的不同，导致单波长测定时的误差较大。并且用不同的洗涤剂会影响到最后加入底物和终止液后的液面情况，用加入表面活性剂的洗涤液清洗后，形成的液面更凹，对单波长检测的影响更大，并且与表面活性剂的浓度成正比。而且中性蒸馏水洗涤后，单、双波长检测的结果基本一致。
5.在酶联免疫法测定抗原抗体中，由于所使用的底物不论是邻苯二胺（OPD）-H2O2，还是四甲基联苯胺（TMB）-H2O2，显色终止后，在630nm和655nm处的吸光度值都只有吸收峰处（492nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用双波长检测，不会影响检测灵敏度。建立在进行酶联免疫检测时，酶标仪比色应该首选双波长。这样可以提高临界值处标本的分析正确度，减少实验误差。
‘叁’ 如何用酶标仪测定RNA浓度
换滤光片，340、280、260、230
石英的96孔板，每个孔的体积为200ul，空白直接200ulDEPC水，实验组196ulPEPC水+4ulRNA
如果换了滤光片了，测试步骤与MTT测试步骤差不多，主要就是设置吸光度，点击四次吸光度，设置为340、280、260、230。
1、进板后确定板类型和板孔
2、设置吸光度，点击四次吸光度，分别设置为340、280、260、230。
3、开始
酶标仪即酶联免疫检测仪是酶联免疫吸附试验的专用仪器又称微孔板检测器。可简单地分为半自动和全自动2大类，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一个比色计,即用比色法来进行分析。 测定一般要求测试液的最终体积在250μL以下，用一般光电比色计无法完成测试，因此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。
‘肆’ 如何用酶标仪检测荧光（荧光，酶标仪，荧光
酶标仪的使用方法可以参考： 1.开启仪器电源开关，预热5分钟，同时启动电脑。 2.启动Magellan.exe程序，加入程序主界面，仪器微孔板架同时自动打开。 3.将待测微孔板在板架上放好。 4.根据不同的测量要求，设置好测定波长和测量模式后，进行检测