A. 细胞凋亡的检测方法及指标
哥们，大学翟中和版的细胞生物学里面就有，很全很详细，似乎就在讲癌细胞的那一章，你去翻翻看，不会让你失望的
B. 如何用DNA Ladder 法检测细胞凋亡
DNA ladder法就是凝胶电泳DNA片段测定法
DNA Ladder 法检测细胞凋亡方法如下：
1、凋亡处理：细胞经凋亡处理后，收集细胞（包括悬浮细胞），用70%乙醇-20度固定2h。
2、裂解细胞： 加400ml细胞裂解液，充分摇匀后再加蛋白酶K（10mg/ml），置65度水浴消化至少2h或过夜。
3、处理蛋白：加75ml 8mol/L KAc，4度 15min，再加750ml氯仿，充分混匀后，离心5000r/min 10min后，将上清移至一新的EP管。
4、沉淀DNA：加入750ml无水乙醇，轻柔摇匀即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20度过夜，12000r/min，10min离心后，用70%乙醇洗DNA两次。
5、溶解DNA：加50ml无菌双蒸水，37度溶解DNA。
6、测定DNA的浓度。
7、2%琼脂糖凝胶电泳80V 2h。
C. 检测细胞凋亡的方法有哪些
一、形态学观察方法
1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
二、DNA凝胶电泳
（一）检测原理
细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
（二）结果判断
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
（一）检测步骤
1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
2、在微定量板上吸附组蛋白体；
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；
4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；
5、加酶的底物，测光吸收制。
（二）用途
该法敏感性高，可检测5*100/ml凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
四、流式细胞仪分析
（一）检测原理
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
（二）应用价值
流式细胞仪检测具有以下特点：
1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
2）、可以做许多相关性分析
3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。
■DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3.的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种：
1、原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3－OH端
2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3－OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL为合适。
■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。
3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是最为理想的检测细胞凋亡的方法。
D. 最常用的细胞凋亡检测方法是什么
细胞死亡的方式主要有两种，包括 细胞坏死（necrosis）和细胞凋亡（apoptosis） 。细胞坏死是早已被认识到的细胞死亡方式，而细胞凋亡是近年来逐渐被认识且越来越受到重视的细胞死亡方式。两种死亡方式最重要的区别是细胞坏死会释放出细胞内溶物， 引起炎性反应 ，而细胞凋亡不会暴露细胞内溶物，一般被吞噬细胞吞噬清除， 不引起炎性反应 。
细胞凋亡，也称 细胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理条件下，细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程 。细胞凋亡是生物体中一种普遍存在的现象，胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关。细胞凋亡在免疫学中也非常重要，如T细胞在胸腺内发育的过程，经过阴性选择和阳性选择后，95%的胸腺细胞发生凋亡，只有5%的胸腺细胞发育为成熟T细胞进入外周。
检测细胞凋亡的方法很多，如电子显微镜或者光学显微镜下的形态学观察、细胞DNA提取物的DNA梯状带电泳实验等。而流式细胞术是非常重要的检测细胞凋亡的方法，不仅可以定性，也可以定量。流式细胞术检测细胞凋亡的方法也有很多，其中最重要是annexinV/PI双染色法。其他的还有SYTO/PI双染色法、细胞DNA含量分析法、线粒体损伤检测法、活化的caspase-3检测法、FLICA标记法、甲酰胺诱导ssDNA单抗检测法、TUNEL法等。今天主要介绍一下annexinV/PI双染色法。
Annexin V/PI双染色法
正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中 磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS） 位于 细胞膜的内表面 ，细胞凋亡时，细胞膜发生变化， PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表 面。 annexinV是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白 ，annexinV可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS，而 活细胞的PS位于细胞膜的内表面 ，无法与annexinV特异性结合。所以可以用FITC偶联的annexinV鉴别凋亡细胞和活细胞。
坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，annexinV也能识别坏死细胞表面的PS，所以 annexinV无法区分坏死细胞和凋亡细胞 。而 PI染料能够与细胞内的DNA结合 ， 区分坏死细胞和活细胞 。凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以 PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞 ，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被FL2或FL3通道接收。所以 annexinV和PI同时使用，就可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞 ，这就是annexinV/PI双染色法检测细胞凋亡的原理。
标记方法与常规标记荧光抗体的方能一样：加入适量的FITCannexinV和PI，4℃静置30min即可。注意 标记PI的方法与PI染色检测细胞内DNA含量的方法不同，不需提前固定细胞 ，因为本方法标记PI是为了检测细胞膜的通透性从而鉴别细胞是活细胞还是死细胞，而用PI检测DNA含量时必须先破坏活细胞的细胞膜的完整性使PI进入细胞内与DNA结合。
下图是用annexinV/PI双染色法检测细胞凋亡得到的一张散点图。图中大致可以分为三大细胞群：右上象限的细胞表型为annexinV+PI+，代表的是坏死细胞；右下象限的细胞表型为annexinV＋PI-，代表的是凋亡细胞；左下象限的细胞表型为annexinV-PI-，代表的是活细胞。通过annexin V/PI双染色法可以非常明确地区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并且可以定量分析各自所占的比例。
例：
下图引自［1］，作者用annexinV/PI双染色法检测肺癌细胞系“H1299”和“A549”细胞凋亡，证明肺癌细胞表面的TLR4受体与LPS结合后，能够增强其抵抗TNFα和TRAIL诱导的凋亡。
从图中可以看出，TRAIL诱导后，H1299肺癌细胞系的凋亡比例从3.36%上升到13.7%，被TNF-α/CHX诱导后，凋亡比例上升到16.9%；如果在诱导前加入LPS，活化H1299表面TLR4信号，被TRAIL诱导后凋亡比例只有3.8%，被TNF-α/CHX诱导后凋亡比例只有3.93%,说明H1299表面TLR4信号的活化能够促进其抵抗凋亡。另一个肺癌细胞系A549的结果也相似，LPS活化TLR4信号后，TRAIL诱导凋亡比例从16%下降到3.09%，而TNF-α/CHX诱导凋亡比例从17%下降到11.8%。
［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by incing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.