荧光素酶分析仪检测方法

⑴ 如何使用多功能酶标仪检测双荧光素酶

报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。
在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

⑵ 荧光素酶报告基因的应用原理

应用原理

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。

荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

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应用

植物基因工程

在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因（nos）、章鱼碱合成酶基因（ocs）、新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。

nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌（Agrobacterium tumfaciens）的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。

nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰（磷酸化、乙酰化等），从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。

常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。

荧光酶基因（luc）是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2+、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。

动物基因工程

在动物基因表达调控的研究中，报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。

cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。

检测因子作用

可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。

来从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的DNA，该项技术正广泛应用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。

由此可知，报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已推广到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。

参考资料来源：网络-荧光素酶报告基因

参考资料来源：网络-报告基因

⑶ 细菌总数的检验方法是什么

细菌总数是水质参数之一，指单位体积水中的细菌总量。其检验方法是:在玻璃平皿内,接种一毫升水样或稀释水样于加热液化的营养琼脂培养基中，冷却凝固后在37°C培养24小时，培养基上的菌落数或乘以水样的稀释倍数即为细菌总数。有的国家把培养温度定为35°C或其他温度，也有把培养时间定为48小时的。

⑷ 荧光检测方法

荧光检测是一种自然发光反应，通过荧光素酶与 ATP进行反应，可检测人体细胞、细菌、霉菌、食物残渣，在15秒钟内得到反应结果。光照度通过专用设备进行测量，并以数字形式予以表示，在1975年首先被应用到食品工业中，在1985年在化妆品制造业中得到应用。
荧光定量：采用国际主流的荧光定量PCR技术，迅速提升技术水平。
结果稳定：检测结果CV值与进口全自动PCR仪接近，具有自检功能，避免错误数据的输出。
封闭操作：全部检测过程均为闭管操作，于反应管处检测荧光，有效防止污染，解决PCR技术中最棘手之难题。
准确定量：满足临床对量化的需求，定量荡围宽，可涵盖大部分病原微生物，自动曲线拟合。
灵敏度高：利用光谱信号灵敏性的优势，有效提高检测灵敏度。
安全：全程无毒检测。
操作简便：省去后处理的烦琐过程。
直接打印：直接打印结果，无须记录大量数据。
升级版：FS1000有与电脑连接的数传输口，可以连接电脑，根据用户需要提供先进分析软件，全面分析实验数据。（电脑和打印机选配件）
故障率低：维护非常简单。
节约资源：可利用现用PCR扩增仪，最大限度节约资源。