沙门氏菌的研究方法

① 什么是沙门氏菌

沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌鉴定的传统方法主要是根据形态学特征、培养特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌体特征等。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。

沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。

感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。

(1)沙门氏菌的研究方法扩展阅读：

预防沙门氏菌感染方法：

1、餐前、便后、接触食物前、接触动物或生蛋后应仔细洗净双手。

2、处理生食和熟食的砧板要分开。

3、食物要熟透再吃(尤其是鸡蛋与家禽类)。

4、非现做现吃的食物应以保鲜膜包覆后放进冰箱保存，再次食用前应加热或煮熟。

5、扑灭并阻隔苍蝇等病媒。被苍蝇沾染、过期或腐败的不洁食物均应丢弃，切勿食用。

6、水塔应经常清洗、消毒。

7、旅行或野营时的饮用水应煮沸并消毒。

8、如有呕吐、腹泻或发热等症状，应尽快就医。

② 肠炎沙门氏菌的检测方法

自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一，通常，沙门氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性质会干扰病原的检测，例如，某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经过加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用，其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难，人们建立了一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出沙门氏菌，这些方法通称为快速检测。
1、传统的培养方法
用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率，这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步(预增菌)，将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，温度37℃，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用(由于其可保持溶液pH值稳定)，但对培养基的选择仍存有争论。第二，是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，与预增菌培养基相似，对选择性培养基的选择，也存在许多不同的观点。目前应用的主要有如下3种类型：连四硫基盐肉汤(Tetrathionatebroth)、硒酸盐胱氨酸肉汤(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果。
2、以抗体为基础的检测方法
利用抗原-抗体反应的显着特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体(ELISA)，荧光抗体染色(免疫荧光法)，同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，概括地说，是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原，经洗涤除去未结合的成分，加入第二种酶标抗体，此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上，第二次洗涤后加入酶作用基质，并令其与颜色成分反应，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。
黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelletest1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌(A-E群)单克隆抗体的微量板，加入经增菌处理的样品，反应后再加入一定的指示剂，作用毕后用酶标仪测定OD值来判定结果。食物样品经适当的增菌处理，也可用此法进行沙门氏菌检测。ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105～106个细胞/ml，因此，要得出可靠的结果，食物样品首先必需进行预增菌、选择性增菌，通常还要在含有D-甘露糖的肉汤(M肉汤)中进行后增菌，以促进鞭毛发育。总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40～48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)样品制备过程分三步，共耗时24h：①选用营养肉汤进行预增菌(6h)，使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏。②使用选择性培养基RV进行增菌(14h)，使沙门氏菌大量繁殖，同时抑制其它杂菌生长。③使用营养肉汤(蛋白胨水)进行后增菌(4h)，使沙门氏菌的数量大大增加。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身，则仅需要大约2h而已(其中30min是操作时间，90min是孵育时间)。相比之下，黎兆滚等人的方法可在27h内完成，比上述方法缩短了一半的时间，颇值得推广应用。最新式的沙门氏菌免疫学检测法，利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。几滴样品加到卡片上，结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作，且由于无需要特殊设备，很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理，但它(卡片法)本身通常需时不超过10min，如果采用黎兆滚等人的样品制备法，则可使操作时间更为缩短。
3、以核酸为基础的方法
细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素、酶或发光的标识物。Fitts等人在食品沙门氏菌检测中引入了第一代DAN—RNA杂交技术，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段，其敏感性高，经大约48h的增菌步骤后，检测极限可达108个细菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，此方法的优点都被抵消了。为此，以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分，每个细菌细胞中存在5000～20000个复制体，而相比之下染色体DNA复制体仅2～10个。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。其另一优点是由于rRNA为单链(而DNA为双链)，杂交前无需经过变性步骤。要得到阳性结果，此法需要105个靶细胞/ml，因此对沙门氏菌检测来说，需要进行预增菌和选择性增菌，总共约50h。rRNA探针法比沙门氏菌ELISA法更耗时，但二者成本相近。食品细菌检测法的最新进展是在化学扩增体系方面的发展，即聚合酶链反应(PCR)，用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。用于检测沙门氏菌和其它以食物为载体的病原的PCR方法业已建立，其中一些方法显示了极好的敏感性。但该法较难自动化，且必需经选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点，但这种方法对那些含沙门氏菌较少或沙门氏菌“致伤”严重难以复苏而仍保有沙门氏菌rRNA的样品尤其有效。

③ 沙门氏菌的培养方法

用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率，这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步（预增菌），将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，温度37℃，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用（由于其可保持溶液pH值稳定），但对培养基的选择仍存有争论。第二，是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，与预增菌培养基相似，对选择性培养基的选择，也存在许多不同的观点。应用主要有如下3种类型：连四硫基盐肉汤（Tetrathionatebroth)、硒酸盐胱氨酸肉汤（Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果。
而血清学鉴定推荐使用权威的丹麦SSI的沙门氏菌血清。

④ 如何实现快速检测及有效控制沙门氏菌

沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性肠杆菌, 也是肠杆菌科中最主要的食源性致病菌。据有关资料统计由沙门氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所占比例已超过三分之二，2007年发生的“ 花生酱事件”以及 2008 年发生的“ 西红柿 事件”等[1]沙门氏菌中毒事件的发生也使得食品中沙门氏菌的检测受到人们的普遍关注。本文主要是对食品中沙门氏菌的传统检测方法以及后续建立的以分子生物学、免疫学、生物传感器和电化学为基础的快速检测方法进行了系统的综述，旨在为该致病菌的检测方法的研究应用提供一定的参考。
1、 传统的检测方法（国标法）
目前, 我国对食品中沙门氏菌的检测大多采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对食品样品进行检测，这种传统的培养方法可分为前增菌、增菌、分离培养、生化试验和血清学鉴定等步骤进行。虽然传统培养法可靠性高，但是其操作繁琐且耗时费力，并不能满足食品快速检测的要求。
2、分子生物学检测方法
2.1聚合酶链反应技术
PCR技术是一项敏感性高、特异性强且快速准确的微生物检测技术，也被许多学者用于对食品中沙门氏菌进行检测和研究。汪琦等[2]就采用传统培养方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 种方法对沙门氏菌进行检测。在常规PCR的基础上宋东晓[3]建立了检测食品中沙门氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技术也运用于食品中沙门氏菌的检测，钟伟军[4]通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法，此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。
2.2核酸探针技术
核酸探针技术是根据核苷酸碱基互补的原理,在已变异的DNA样品中加入用同位素等标记的DNA特异片段，在一定条件下两片段进行杂交从而达到检测DNA的目的。此技术不仅简便、快速而且敏感性高、特异性强，已用于食品中沙门氏菌的检测。Almeida等[5]通过建立一种新颖的肽核酸探针结合荧光原位杂交方法对血液、粪便、水以及婴儿奶粉样品中沙门氏菌进行了检测，准确度高达 100%。
2.3基因芯片技术
基因芯片技术是利用已知核酸序列的探针与靶核苷酸序列杂交，然后通过信号检测对其进行定性与定量分析，在沙门氏菌等各种致病菌的分析检测中有很好的应用前景。饶宝等[6]通过建立检测致病菌的基因芯片检测方法，设计了通用引物和特异性探针: 沙门氏菌探针、大肠杆菌探针和金黄色葡萄球菌探针,实现了同时检测并区分沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的目的。祝儒刚等[7]运用多重 PCR 结合基因芯片技术建立了检测肉及肉制品中的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌等5种食源性致病菌的快速检验方法。
2.4噬菌体裂解技术
噬菌体有特异性裂解细菌的作用。张碧波等学者利用此技术进行沙门氏菌
快速检测，结果和其他学者相同，据此得出特异性噬菌体可以检测出沙门氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌体裂解对150份食品样品进行快速检测，结果说明肠杆菌科噬菌体组合对培养10h的沙门氏菌敏感性和特异性较高，这对实现沙门氏菌实时、快速而准确的检测有重要意义。
2.5环介导等温扩增技术（LAMP）
环介导等温扩增技术是2000年Notomi等开发的一种新的恒温核酸扩增方法,此方法的特点是特异性强、灵敏度高且简单、快速,适合对大规模样品的快速检测[9]。李佳桐[10]通过实验建立了沙门氏菌的LAMP检测方法,并将此方法与常规PCR进行比较,结果显示：LAMP方法对沙门氏菌的检测恒温65℃下只需要40min,只扩增沙门氏菌,不会扩增其他革兰氏阴性菌,最低可检出浓度10cfu/mL,比常规PCR的最低检出浓度高1个数量级,通过添加荧光染料SYBR Green Ⅰ,能够快速简便的观察检测出绿色的阳性结果十分明显的区别于橙色的阴性结果。
3、免疫学方法
3.1酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附法简称 ELISA， ,此技术敏感性高 ,不需特殊设备 ,结果观察简便，早在1977年就有报道将酶联免疫吸附法用于食品中沙门氏菌的检测。伍燕华等[11]设计捕获抗体和检测抗体，建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法对食品中的沙门氏菌进行检测。张帅等[12]建立双抗夹心ELISA体系，检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800CFU/g，等均并与其他血清型沙门氏菌、单增李斯特菌等菌均无交叉反应,特异性良好。
3.2免疫荧光标记技术
免疫荧光标记技术是根据抗原抗体的特异性反应，将荧光素标记在已知抗原(或抗体)上,与特异抗体(或抗原)结合后产生荧光，可用来定位抗原或抗体、并通过定量分析，确定测定含量。叶明强[13]基于纳米免疫磁珠富集,免疫量子点标记,建立了一种食品中沙门氏菌的含量进行快速检测的方法，研究出了一种新型的免疫荧光食源性致病菌检测技术。
3.3斑点免疫金渗滤法
免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物结合免疫原理的一种应用于抗原抗体的新型技术，该技术运用最广泛的就是斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技术对沙门氏菌的快速检测进行了研究，曹春梅等[14]是利用斑点免疫金渗滤法对沙门氏菌O9抗原进行了研究，结果表明此法简单、快速，适合推广运用；孔繁德等[15]是通过建立直接检测沙门氏菌的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒对该菌进行了研究。
3.4免疫磁性分离技术
免疫磁珠分离技术是将特定病原体的单抗或多抗与磁珠微球偶联，并通过抗原抗体反应形成磁珠，在外加磁场作用下磁珠会发生定向移动，从而达到分离目标病原体的作用。食品样品中致病菌含量很少，常规的方法是很难从中分离出来的，借助免疫磁性分离技术可以达到快速分离的目的。王海明等[16]应用磁免疫技术建立快速检测食源性沙门氏菌的方法，结果表明此方法能对食品基质中的目标菌进行快速有效的富集,其检测限<10cfu/25g,检测周期约为40小时。胡霏[17]也通过实验针对鼠伤寒沙门氏菌建立免疫磁分离技术结合荧光层析技术的快速检测方法。
4、生物传感器技术
生物传感器是利用一些生物活性物质如酶 、多酶体系 、抗体等做为敏感器件，然后配以适当的信号传导器所构成的分析检测的工具。我国学者已采用此法对沙门氏菌的抗原、抗体的免疫吸附进行检测，并已用于快速检测食品中致病的沙门氏菌，而仅需 1h 完成，达到了快速的检测目的。宁毅[18]在对碳纳米管性质研究的基础上,结合分子探针构建了碳纳米管生物传感器，并将其用于沙门氏菌的检测，结果显示所构建的传感器灵敏度高、特异性强、稳定性好。
5、电阻抗技术
电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，因为具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点，目前此法已用于食品中沙门氏菌检测检验并已通过美国公职分析化学协会(AOAC)认可。陈广全等[19]建立了电阻抗法快速检测食品中沙门氏菌的方法，并将其与常规培养法进行比较，对食品中的沙门氏菌属进行检测,结果表明电阻抗法比传统培养法更加快速、可靠。
6、总结
综上所述，沙门氏菌检验技术正从传统的培养方法向分子检测方法改进，并向仪器化、标准化、自动化方向发展，并且食品安全、致病菌等问题对人类健康以及生活环境都造成了严重威胁，加强沙门氏菌检测势在必行。目前沙门氏菌快速检测技术大多具有检测迅速、灵敏度高、特异性强等特点，此外这些方法还具有各自的优点和局限性，在未来发展过程中需要我们不断改进和创新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙门氏菌快速检测技术。

⑤ 做大肠杆菌 沙门氏菌 葡萄球菌 巴氏杆菌的实验检测 一般都用什么方法 和仪器设备 请说的详细些

大肠埃希菌（Escherichia coli）
取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18~24小时，必要时可延长至48小时。
取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时，24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18~24小时。

若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。
表1 大肠埃希菌菌落形态特征
培养基 菌落形态
曙红亚甲蓝琼脂 显蓝黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽
麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润

沙门菌（Salmonella）
取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18~24小时。
取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18~24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18~24小时（必要时延长至40~48小时）。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表4所列特征，判供试品未检出沙门菌。
若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2~3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18~24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。
表4 沙门菌菌落形态特征
培养基 菌落形态
胆盐硫乳琼脂 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色
沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色
曙红亚甲蓝琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落
麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2)，直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的亚硫酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养18~24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24~72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
表5 金黄色葡萄球菌菌落形态特征
培养基 菌落形态
甘露醇氧化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.7~1mm
卵黄氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1~2mm
若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2~3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18~24小时，作为浆凝固酶试验。
血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液（1：1）0.5ml，再分别加入可凝固株的营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另取制备血浆，重新试验。
若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

⑥ 肠道致病菌的分类及常用检测方法

根据可培养细菌的数量分类在肠道菌群中，可以培养到的细菌有400余种，依据其数量多少可以分为主要(优势)菌群(predominant microflora)和次要菌群(sub—dominant microflora)。

①主要(优势)菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在10～10cfu/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。

②次要菌群：数量在10～10cfu/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。

检测方法：

1、采样及稀释

（1）按无菌操作法将检样25g（或25mL）放于含有225mL无菌水的三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000～10000r/min的速度离心1min，做成1：10的稀释液。

（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1Ml，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀释液。

（3）根据食品的卫生要求或对检验样品污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。

2、乳糖初发酵试验

即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管。

lmL及1mL以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管。每一个稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

3、分离培养

将产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置36±1℃温箱内培养18～24h，然后观察菌落形态并作革兰氏染色、镜检并作复发酵试验。

4、乳糖复发酵试验

即通常所说的证实试验，其目的在于证明经乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。

在上述选择性EMB培养基上，挑取可疑的大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置36±l℃温箱内培养24±2小时，观察产气情况。

凡乳搪发酵管产气，革兰染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰染色为阳性，则报告为大肠菌群阴性。

(6)沙门氏菌的研究方法扩展阅读：

有益菌菌群的生理功能：

如果肠内有益菌菌群占优，肠内黏膜呈现粉红色，表示肠内环境相当良好。

1、吸收水分，粪便较软，较易排泄

在胃部分解消化的食物，经由小肠吸收营养后，成为粘稠状物体送至大肠。然后再经过18小时将水分及矿物质吸收，就变成容易排泄的粪便。肠道内环境良好时，粪便的软硬适中，排便会较为顺利。

2、缓和的蠕动，能顺利将粪便排出

借由肠的蠕动，将粪便缓慢的推送至肛门。如果蠕动过快或太慢，都将影响粪便的构成，导致便秘或者腹泻。而如果肠内干净，则蠕动的速度就相当的有规律，粪便可顺利排出。

3、有助维他命的合成

比菲德氏菌等好菌能维护肌肤的健康，并具有合成有助热量产生的维他命B1、B2及B6等，以及与止血、骨骼形成有关的维他命K等之功用。健康的肠道，好菌会不断繁殖，维他命的合成也可顺利进行。

4、迅速排出有害物质

健康的肠道并非完全没有坏菌的存在，有害物质多少会产生。当然还包括，吃进体内的食品化学添加物或是无法成为营养成分的物质。只要肠内环境良好，这些物质在开始危害身体前就被排出体外。

5、避免病原菌的侵害

比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身体的免疫机能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特质，所以像是含有好菌的乳酸饮料或健康食品等，都可抑制病原菌在肠内繁殖。

肠道有益菌菌群除了以上功能之外，对人体还有营养作用，如糖尿病、高血压、高血脂等。B族维生素和非必需氨基酸对人类的毛发具有重要的作用，当缺少这些营养元素，会导致头发脱落或毛发发黄、发叉，容易折断等现象。

⑦ 沙门菌的实验室诊断程序是什么

实验室检验程序如下：
1。检验程序
直接镜检 p-标本采取与处理一增菌培养被检材料血清学检查（凝集反应等）
2。检验方法
(1)标本采取与处理可采取粪尿、血液、水源、禽蛋、食 品等作为标本送检。采取标本如在疾病后期或用过抗菌药物 之后，粪中沙门氏菌的含量锐减，需用增菌培养基（一般用
0。
5%亚硒酸盐肉汤）接种1克左右的粪便，37℃过夜后再分 离。尿经离心沉淀后，取沉淀物直接分离或予以增菌法同 粪便。食物和食物中毒标本经用前增菌或选择性增菌，再分 离培养。对血清学试验呈阳性的家禽或其他被检禽须先作剖 检，取脏器、心血、心包液、卵巢和输卵管或其他病变组织，直 接在S。
S或麦康凯琼脂平板上，涂布分离培养。
(2)直接镜检标本直接涂片染色镜检,沙门氏菌为革 兰氏染色阴性、无夹膜和鞭毛、有菌毛的直杆状菌。大多数细 菌为周毛菌，具有活泼运动性，但鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙 门氏菌恒定地无运动力。
(3)分离培养为了提高阳性检出率和血清学鉴定时减 少诱导手续，应进行增菌或选择性增菌。
同血清型沙门氏菌 在各种选择性增菌培养中的生长能力并不一致，可用几种选 择性增菌方法。分离沙门氏菌一般常用琼脂，但亚硫酸 铋琼脂（BSA)的分离率高于S。 S琼脂。但BSA不适宜于分但必须与当地致病型对口，效果才好。致病性大肠杆菌，大多 能合成K88ab或K88'这种细胞壁抗原包被在大肠杆菌表面, 使大肠杆菌粘附于小肠黏膜引起下痢。
致病性大肠杆菌还能产生L℃毒素（不耐热）、S℃毒素 (能耐热）和溶血毒素（能引发仔猪水肿病或黄痢，死亡率可 高达100%)。日本曾因0157型大肠杆菌造成人的严重腹泻 症。仔猪白痢主要发生于7 ~30日龄仔猪，多由08、1<88或 060、0„5等血清型大肠杆菌引起。
犊白痢主要发生于10日龄 以内犊牛。大肠杆菌、类大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌均可 致病,分肠型、败血型、肠毒血型三型。羔羊3 ~8周易患“羔 羊大肠杆菌病”，冬、春多发，由那波里大肠杆菌引起。
幼禽（鸡、鸭、鹅、火鸡、肉鸽）都能发病，作为肠道中的常 在菌，还能通过种蛋传染。
以2 ~4周龄最易感。各种应激因 素如卫生不良，饲养管理不当，气候突变，营养缺乏，禽舍潮 湿、拥挤或其他传染病（法氏囊炎、鸡新城疫）爆发时,易诱发 大肠杆菌病。