核酸检测用的哪种化学分析方法

‘壹’ 核酸检测是怎么检测

核苷酸增加无损检测技术，是一系列立即检验病原菌核苷酸的技术性统称，包含基因表达介导的核苷酸增加无损检测技术(TMA)、即时莹光聚合酶链反应(PCR)，根据对靶核苷酸立即增加或对其附加的数据信号增加的方式，使极为少量的核苷酸变为形象化的光学或可视性数据信号。

一、血液为何需要开展dna检测？
因为基本的血液血清学无损检测技术方法学要素，包含酶链免疫吸附实验(ELISA)、电化学发光免疫力剖析实验(CLIA)，会使一些病原菌不检和漏验，经血清学检测阴性的血液也并并不是100%安全性的，仍存有静脉注射传播疾病的风险性。关键原因:基本检测病毒的漏捡:病毒感染感染者“潜伏期”捐血、病毒变异、免疫力缄默性感染(immunosilent infection)、人工服务实际操作不正确。一些己知病毒感染未检验:如CMV、B19、HTY、登革热病、Pion等。未知病毒:探索与发现病毒感染，如WNV、SARS、寨卡病毒等。选用核苷酸增加检验则可减少经血液传播疾病的风险性。

二、血液dna检测的实际意义
1.减少乙肝检测潜伏期，减少静脉注射风险性。说白了“潜伏期”，就是指从感染病源刚开始，直到用某类检验方式可以检验到该病源存有才行的这一段时间。因为感染后病毒颗粒在于抗原体、抗原释放出来入血，如HCV感染后，在将近1～3月的时间里，感染者身体没有或仅有少量而没法检验出的抗原，而血液却具备感染性。因而抗原体、抗体检测的“潜伏期”较长，如HBsAg、抗HIV检验的“潜伏期”各自为56d和22d，抗-HCV检验的“潜伏期”则长达70d。研究表明，(NAT)检验的确可以减少潜伏期，但针对不一样的病毒感染，其高效率也是有差别，这与血清学检验的基本值和dna检测实验试剂的敏感度相关。
2、别的优点：血液dna检测除开能显着减少潜伏期外，与血清学方式对比，也有本身优点：
(1)敏感度高，特异性强:dna检测敏感度远超医学免疫学方式检验，此外，核苷酸碱基配对的精确性决策了dna检测的特异性能比医学免疫学检验强。

(2)一些特殊情况dna检测可能是唯一的方式:如外周血单核细胞中或肝脏中融合的病毒感染;病毒感染的亚型或变异性;抗原体基因变异后抗原融合结构域转变或不产生抗体;产生抗原体一抗原一氧化氮合酶，使医学免疫学检验展现假阴性;感染中后期或漫性感染时抗原体/抗原
三、在我国血液dna检测状况

‘贰’ 核酸检测能选择用哪种方式么

目前主要使用的方法有以下六种方法：
一、核酸序列依赖性扩增法
NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42 ℃进行 ,可在 2 h内将RNA模板扩增约 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA 退火, 在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量扩增。
二、转录介导的扩增技术
TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在 41.5 ℃进行 ,可在 1 h内将RNA模板扩增约109倍。
三、连接酶酶促链式反应(LCR)
LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起 来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。
四、多聚酶链反应检测法(PCR)
PCR技 术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。
① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
③ 引物的延伸：DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成1条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的 “半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成1个循环需2～4 min， 2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIVRNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可，这样的反应称为RT-PCR。
五、实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
本技术的原理是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间, 利用Taq酶的5′3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到, 一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。
六、支链DNA检测法——bDNA
bDNA是定量检测血浆中的HIV1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段,在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒颗粒中释放出来,然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷酸复合物。再加入1种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染,这 较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测HIV某些变异株,但灵敏度不及PCR，提高bDNA灵敏度是一大难点

‘叁’ 迄今为止，我国检测新冠病毒有哪些方法

1、荧光PCR法。PCR法指的是聚合酶链式反应，能将微量的DNA大幅增加。荧光PCR检测的原理为——随着PCR的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。最后通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
2、联合探针锚定聚合测序法。这种检测主要是用专门的仪器检测测序载片上DNA纳米球携带的基因序列。这种检测的灵敏度高，不容易漏诊，但结果也容易受多种因素的影响而不准。
3、恒温扩增芯片法。检测原理是基于核酸之间的互补结合特性开发的一种检测方式，能够用于定性或定量测量存在于生物体内的核酸。
4、病毒抗体检测。抗体检测试剂是检测血清中由病毒进入人体后刺激人体产生的IgM或IgG抗体，IgM抗体出现较早，IgG抗体出现较晚。
5、胶体金法。胶体金法是用胶体金试纸进行检测，也就是常说的快速检测试纸。这种试纸经过特殊标记，上面有孔，用于滴入受检者的血清样本。
6、磁微粒化学发光法。化学发光法是一种高度敏感的免疫检测，凡具有抗原性的物质都可以用这种方法测定。

‘肆’ 核酸含量的测定方法及原理都有哪些

核酸检测的主要原理其实是反转录和聚合酶链式扩增反应。也叫做RT-PCR。目前对新型冠状病毒进行的核酸检测也主要采用此种方式。简单来说就是采取患者鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便，检测人员通过。核酸提取试剂盒提取患者标本里边儿的核酸，然后把提取到的核酸放进检测试剂中进行复制扩增。然后再根据检测结果进行判断如果是阴性代表没有感染，如果是阳性代表有感染。目前对新型冠状病毒核酸检测会存在假阴性的可能，所以可以选择多次测量。如果连续两次核酸检测为阴性，同时没有临床症状可以排除感染，并且对已经感染了新型冠状病毒肺炎的患者，如果连续两次检测核酸为阴性，注意间隔时间必须大于一天，同时临床症状缓解，影像学好转也可以解除隔离。

‘伍’ pcr核酸检测是什么意思方法及步骤

核酸检测是目前全球用来对是否携带新冠病毒进行确定的一种有效方式。目前大家主要使用的是鼻拭子、咽拭子以及抗体血清lgm进行参考。但是根据最新的新加坡入境要求是进行pcr核酸检测，那么pcr核酸检测是什么意思呢？

pcr核酸检测是什么意思

PCR的意思是聚合酶链式反应，能够用来扩增DNA，从而将微量的DNA扩增到能够检测的程度。有些病毒的核酸是DNA，需要采用这个方法进行检测。所以PCR并不是进行的检查，而是检测DNA的一种方法。比如乙肝病毒DNA定量，用的就是这一种方法。检查DNA的目的，一方面是可以诊断疾病，如果连病原体的DNA都能检测到，就说明感染了这种病原体;另一方面是判断病毒复制的多少，从而判断病情严重程度或者治疗效果。

pcr核酸检测方法与步骤

进行核酸检验，需要经过取样、留样、留存、核酸提取、上机检测五个步骤。

核酸检测的第一步就是采集人体分泌物，用鼻试子或咽试子擦拭鼻腔或咽后壁及双侧咽扁桃体处。

第二步医务人员进行留样，将试子头浸入细胞保存液中，折断尾部后立即旋紧管盖。

第三部要将样本放入密闭袋中，保存好并及时送检。

第四步将样本送进实验室，提取核酸。

第五步，将提取物进行荧光PCR扩增反应。

核酸是什么

核酸(nucleicacid)，是一类由核苷酸(nucleotide)构成的生物大分子，分为核糖核酸(ribonucleic
acid，宴前者RNA)和脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic
acid，DNA)两类，其中RNA多为单链结构，DNA多为双链结构。除朊病毒(prion)外，核酸是构成生命所必需的生物大分子，其主要作用是构成生命体的遗传信息载体，除此之外，还有部分核酸可作为及参与构成具有生物活性的酶分子或晌薯其他分子机器
。

核酸检测是什么

核酸检测顾名思义就是针对核酸开展检测。

核酸检测有何独特的优势呢?为何能作为新冠病毒确诊的“金标准”呢?

其实每一种检测方法都有其擅长的应用场景。以病毒检测为例，通常的免疫学检测方法(胶体金、ELISA、化学发光等)的检测对象是病毒的抗原或抗体，相当于“侧面描绘”。由于从感染到可检测存在一个时间窗口期，因此免疫学检测方法一般不合适作为早期诊断。

假阳性与假阴性

1、假阳性

假阳性通常比较少。一般实验室人员操作不当会导致样本间交叉污染或扩增产物的遗留污染，该种情况下可能会导致假阳性。

不过假阳性可以通过严格控制检测流程、以及执行若干个阴性样本随机参与检测的策略而有效规避。

2、假阴性

在这里需要说明的是，PCR检测的假阴性与临床的假阴性实际上不是一个概念。

以网络上激烈讨论的新冠病毒的诊断为例，临床假阴性是指临床症状和影像学高度疑似被感染、但PCR检测却多次或始终为阴性的情况;而PCR检测假阴性是指所采集样本中存在足够量的新型冠状病毒但却没有检出悔简的情况。

避免核酸检测的假阴性，主要需要解决：(1)被感染者的细胞中有足量的病毒、(2)采集样本中可以采集到含有病毒的细胞、以及(3)检测出样本中的病毒这三个环节。

其中PCR试剂盒的技术参数优劣主要影响第三个检测环节。

仅针对第三个检测环节，若样本中病毒数量低于一个程度(低于最低检测限)，PCR试剂盒就无法检出。从这个角度看，PCR检测的假阴性是无法完全避免的。这也是为何需要补充开发病毒的特异抗体检测的原因所在。

沈阳PCR核酸检测实验室

实验室建设坚持高标准、严要求，严格按照国家《医学生物安全二级实验室建筑技术标准》进行建设，建设面积100余平方米，分为试剂贮存和准备区、标本制备与提取区、扩增和产物分析区三个区域。实验室内配置全自动核酸提取仪、实时荧光定量PCR仪、扩增仪、高压灭菌器、B2型生物安全柜、超净工作台、超低温冰箱等仪器，消毒和防护设施齐全，符合相关生物实验室安全标准。为防止实验室外的区域被污染，实验室的气压均为负压，有效降低感染风险。此外，实验室配备了污水处理系统，达到了废液的合理排放和处理。

*目前我国多地区建设了PCR核酸检测实验室用以进行新冠病毒核酸检测

‘陆’ 核酸检验方法

核酸检测具体流程如下：
1. 核酸提取
使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。
2. 逆转录合成cDNA
逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。
3. PCR扩增反应（使用二次扩增的套式PCR扩增方法）
PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板（DNA或cDNA）。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法。
4. 扩增产物定性分析
扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。
5.结果判定和完成报告单
（1）实验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。
（2）HIV核酸检测阳性：发现核酸阳性反应，应该重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。
（3）HIV核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。
（4）应在完成检测后5个工作日内发出检测报告。

‘柒’ 核酸检测原理

核酸检测原理：每一个生物的核酸是不一样的，通过核酸检测就是要确定人身上是否带有病毒，也就是为了检出病毒的携带者。病毒携带者如果有症状的话就是病人，如果没有症状就是无症状感染者。

核酸检测也是检测病毒的方法，它可以更早发现感染。现在临床中对乙肝、丙肝、艾滋病都开展了核酸检测，可以在抗体产生前检测到血液中是否存在病毒。

而一些呼吸道疾病可以通过咽拭子或者呼吸道分泌物的核酸检测来判断是否感染，以及推测是否具有传染性。季节性流感、禽流感、冠状病毒感染等通过咽拭子检测可以方便地判断出上呼吸道是否存在病毒成分，从而判断被检测者是否属于感染者。

(7)核酸检测用的哪种化学分析方法扩展阅读：

新冠病毒的核酸检测已经是比较成熟的检测方法了，只要在咽喉部位擦拭几秒钟就可以采集到标本。通过分析判断是否有新冠病毒的核酸成分，可以尽早发现感染者，甚至在感染者出现症状前就可以检测到阳性。

感染者经过隔离治疗后咽拭子检测阴性说明病毒已经清除，不具有传染性了。目前两次咽拭子核酸检测阴性是确诊病例和无症状感染者解除隔离的标准之一。