荧光法是什么检测方法

㈠ 荧光检测方法

荧光检测是一种自然发光反应，通过荧光素酶与 ATP进行反应，可检测人体细胞、细菌、霉菌、食物残渣，在15秒钟内得到反应结果。光照度通过专用设备进行测量，并以数字形式予以表示，在1975年首先被应用到食品工业中，在1985年在化妆品制造业中得到应用。
荧光定量：采用国际主流的荧光定量PCR技术，迅速提升技术水平。
结果稳定：检测结果CV值与进口全自动PCR仪接近，具有自检功能，避免错误数据的输出。
封闭操作：全部检测过程均为闭管操作，于反应管处检测荧光，有效防止污染，解决PCR技术中最棘手之难题。
准确定量：满足临床对量化的需求，定量荡围宽，可涵盖大部分病原微生物，自动曲线拟合。
灵敏度高：利用光谱信号灵敏性的优势，有效提高检测灵敏度。
安全：全程无毒检测。
操作简便：省去后处理的烦琐过程。
直接打印：直接打印结果，无须记录大量数据。
升级版：FS1000有与电脑连接的数传输口，可以连接电脑，根据用户需要提供先进分析软件，全面分析实验数据。（电脑和打印机选配件）
故障率低：维护非常简单。
节约资源：可利用现用PCR扩增仪，最大限度节约资源。

㈡ 荧光光度法原理

方法提要

水样用高氯酸-硫酸-钼酸钠消化，再用盐酸将硒(Ⅵ)还原为硒(Ⅳ)。在酸性条件下，硒(Ⅳ)与2，3-二氨基萘反应生成有绿色荧光的4，5-苯并苤硒脑，用环己烷萃取，在激发波长376nm，发射波长520nm下，进行荧光光度法测定。

本法适用于海水、天然水中总硒的测定，若试样不经酸处理，可直接测定四价硒的含量。方法检出限为0.2μg/L。

仪器和装置

荧光分光光度计。

电动振荡器。

试剂

盐酸。

高氯酸。

硫酸。

去硒硫酸量取200mLH₂SO₄在搅拌下，徐徐加入200mL水中，加30mLHBr，混匀，置沙浴上加热至冒白烟。

氢溴酸。

氢氧化铵。

环己烷若有荧光杂质需重蒸馏提纯，用过的环己烷重蒸馏后可再使用。

EDTA溶液(0.2mol/L)称取37gEDTA二钠盐于250mL烧杯中，加适量水，加热溶解，冷却后稀释至500mL。

盐酸羟胺溶液(100g/L)称取10gNH₂OH·HCl于100mL烧杯中，用水溶解后，并稀释至100mL。

EDTA-盐酸羟胺混合溶液量取100mL0.2mol/LEDTA、10mL100g/L盐酸羟胺溶液，加水稀释至1000mL。

2，3-二氨基萘(DAN)溶液(1g/L)称取400mgDAN于500mL烧杯中，加400mL0.1mol/LHCl溶解，然后转入1000mL锥形分液漏斗中(漏斗颈部塞有脱脂棉)，在振荡器上振荡15min使其全部溶解。加入80mL环己烷再振荡5min，静置分层后，收集水相，弃去有机相，如此反复纯化数次，直至有机相的荧光强度降到接近纯环己烷的荧光强度为止。将纯化后的DAN溶液贮存于棕色瓶中，加入环己烷使其覆盖液面约1cm厚，置于冰箱中保存，有效期一个月。

高氯酸-硫酸-钼酸钠混合溶液称取7.5g钼酸钠(Na₂MoO₄·7H₂O)溶于150mL水中，加入200mLHClO₄和150mL去硒H₂SO₄，混匀。贮存于500mL试剂瓶中。

硒标准储备溶液ρ(Se)=0.40mg/mL称取0.1405g二氧化硒(SeO₂，纯度99.9%)于50mL烧杯中，用适量水溶解后，移入250mL容量瓶中，加0.1mol/LHCl至标线，混匀。

硒标准溶液ρ(Se)=0.100μg/mL用0.1mol/LHCl逐级稀释硒标准储备溶液配制。

甲酚红指示液(0.4g/L)称取40mg甲酚红于100mL烧杯中，加少量水及2滴(1+1)NH₄OH溶解，加水至100mL。

校准曲线

取6个50mL烧杯，分别加入0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL和4.00mL硒标准溶液，加水稀释至约10mL，混匀。

加5mL混合酸溶液，在沙浴中加热消化至冒浓白烟，至溶液变黄(约2h)。取下冷却至室温，溶液恢复为无色，用水释至约10mL。加5mLHCl，将烧杯放在沙浴表面加热至溶液变黄为止。取下冷却至室温。

将溶液移到50mL比色管中，用少量水洗净烧杯，洗液并入比色管中。加5mLEDTA-盐酸羟胺混合溶液，4～5滴(0.4g/L)甲酚红指示液，用(1+1)NH₄OH或0.1mol/LHCl调节pH为1.5～2.0(粉橙色)，加3.0mLDAN溶液，摇匀，置沸水浴中加热5min取下冷却到室温。将溶液移入60mL分液漏斗中，用少量水洗涤比色管，洗液并入分液漏斗中。加3.0mL环己烷，振摇4min，分层后弃去水相。

将环己烷层从分液漏斗口到入1cm比色皿中，在荧光分光光度计上，以376nm为激发波长，520nm为发射波长，环己烷为参比，测定硒的荧光强度I_i。以荧光强度I_i-I₀(标准空白)为纵坐标，相应硒含量(μg)为横坐标绘制校准曲线。

分析步骤

量取5.00～50.0mL海水样，于50mL烧杯中加5mL混合酸溶液，在沙浴中加热消化至冒浓白烟，至溶液变黄(约2h)。以下按制定校准曲线步骤测定荧光强度I_w。同时测定分析空白荧光强度I_b。

由I_w-I_b查校准曲线得硒量，海水样硒浓度的计算参见式(78.30)。

注意事项

1)配制DAN溶液时应在暗处进行。

2)在沸水浴上加热5min后，用冷水冷却的时间控制在10min内。否则结果会稍偏低。

3)甲酚红指示剂有两个变色范围，当pH2～3时由红变黄，pH7.2～8.8时由黄变红。本方法中调节pH为1.5～2.0时至粉橙色，pH<1.5为桃红色。因此调pH时要注意颜色变化，必要时可用精密pH试剂确证。

4)玻璃器皿用HNO₃溶液浸洗2～3d，洗净后使用。

5)试样制备。海水样品用玻璃或塑料采样器采集，水样应及时经0.45μm滤膜(滤膜预先在0.5mol/LHCl中浸泡12h，用纯水冲洗至中性，密封待用)过滤，并用HNO₃酸化至pH<2，贮存于聚乙烯塑料瓶或硬质玻璃瓶中，再以聚乙烯薄膜袋包封样品瓶。

6)水样体积的校正。在量取测定水样之前向水样加入的试剂溶液超过1%体积时，按式(78.31)进行体积校正。

7)水样中硒含量低时，可增加水样体积至50mL，对测定无影响。

㈢ 分子荧光分光光度法

分子荧光分光光度法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。

由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收的紫外-可见光波长和发射光的波长也不同，同一种物质应具有相同的激发光谱和荧光光谱，将未知物的激发光谱和荧光光谱图的形状、位置与标准物质的光谱图进行比较，即可对其进行定性分析。

荧光分光光度计是最常见的实验仪器，主要用于对经光源激发后产生荧光的物质或经化学处理后产生荧光的物质成份分析。在检测食品安全、自然环境污染等重要的人类课题上，发挥积极的作用。

荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器，有滤光片荧光计、滤光片-单色器荧光计等，通常均由以下四个部分组成：激发光源、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器、样品池及测量荧光的检测器。