植物多糖分析方法搜狐

‘壹’ 多糖类的提取方法

一、提取与纯化动植物中存在的多糖或微生物胞内多糖，因其细胞或组织外大多有脂质包围，要使多糖释放出来，第一步就是去除表面脂质，常用醇或醚回流脱脂。第二步将脱脂后的残渣以水为主体的溶液提取取多糖 （即冷水，热水，热或冷的0.1-1.0mol/L NaOH，热或冷的1%醋酸或1%苯酚等），这样提取得到的多糖提取液含有许多杂质，主要是无机盐，低分子量的有机物质及高分子量的蛋白质、木质素等。第三步则要除去这些杂质，对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化 （如蛋白酶．木质素酶） ，乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法。多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法，后者较为剧烈，对于含呋喃糖残基的多糖由于连接键不稳定，所以不宜使用。但该法效率较高，操作简便，植物来源的多糖常采用该法。上述三种方法均不适合于糖肽，因为糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。除去蛋白质后，应再透析一次，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析，可以将不同分子大小的多糖进行分离和纯化，该法在除去小分子物质十分实用，同时能满足大生产的需要。具有广阔的应用前景。至此，得到的提取液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。一般来讲，通过上述方法所得到的是多糖的混合物，如果要得到单一的多糖，还必须对该混合物进行纯化。柱层析在多糖的纯化较为常用，常分为两类：一是只有分子筛作用的凝胶柱层析， 它根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶，以及性能更佳的Sephacryl等。洗脱剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，其离子强度不应低于0.02mol/L。二是离子交换层析，它不仅根据分子量的不同，同时也具有分子筛的作用，常用的交换剂有DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖和 DEAE-琼脂糖等，此法适合于分离各种酸性，中性多糖和粘多糖。多糖的纯化还可用其他方法，如制备性高效液相层析、制备性区带电泳，亲和层析等，这些方法有时对制备一些小量纯品供分析用是很有用处的。

‘贰’ 植物组织中糖的测定方法有很多种,举例说明他们的原理和优缺点

有许多不同的分析技术用于糖的分离和测定,包括化学分析、比色分析、纸色谱、薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱等。本文总结了近十年植物组织中糖类化合物的研究进展，为其含量测定提供理论依据。

1 分光光度分析法

分光光度法是基于长链多糖在水溶液中离解后可与染料等阳离子相互结合发生反应，从而引起染料吸收光谱的变化进行测定。这种方法具有较好的选择性，可以用于实际样品的测定，通常有两种常见方法。

1.1 蒽酮 - 硫酸比色法

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为 630 nm，可在此波长下进行比色。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖和己糖而且可以测寡糖和多糖，在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量。蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，但测定结果误差较大，只能测定样品中可溶性糖总量。陈鸿英等人用蒽酮硫酸法测定淫羊藿多糖的含量，得到的结果较稳定。

1.2 苯酚 - 硫酸比色法

植物体内的糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定糖的原理是在浓硫酸作用下，糖脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10mg～100 mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定 160 min 以上。

2 气相色谱法

气相色谱法是以气体作为流动相的一种色谱分析方法气相色谱法测定糖类，具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快速准确、灵敏等优点。曾昭睿采用三 - 端烯丙基 - 不对称二苯并 14- 冠 - 4- 二羟基冠醚做固定相分离了鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的乙酸酯衍生物。吴建元等人利用气相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成结果 6 种标准单糖的衍生物实现了良好的分离并具有良好的峰形。胡磊等人用 1 一甲基咪唑为溶剂和催化剂、盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试剂，对植物样品中糖与糖醇进行乙酰化衍生化利用气相色谱分离和质谱鉴定的分析方法。

3 高效毛细管电泳法

除了少数带有羧基和磺酸基的糖类化合物，绝大多数糖类化合物不带电荷，极性很大且没有发色基团。所以用一般的高效毛细管电泳系统无法得到分离和检测。为了使糖类化合物能产生电迁移而得以相互分离，可采用的方法有：（1）衍生化使之带上发色、荧光基团或电荷；（2）与硼酸盐等络合；（3）与缓冲液中的添加剂形成包合配合物；（4）高 pH缓冲条件下使之电离；（5）加入表面活性剂使形成胶束。20世纪 90 年代以来毛细管电泳因具备分离快速，所需样品量少和自动化程度高的特点，已广泛应用于糖化合物的分析。

4 高效液相色谱法

HPLC 用于糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点。从大量的文献报道和综述中可以看出，由于糖的特殊结构及它本身不含强紫外和荧光吸收的官能团，到目前为止还没有建立一个统一的方法来分析所有的单糖和低聚糖。分析糖的色谱柱有化合键合烷基柱、阴阳离子交换柱、氨基键合硅胶柱和硅胶柱等。

文献来源：孙艳涛，由欣. 植物组织中糖化合物测定方法的研究进展.科教文汇(上旬刊). 2011,10(上旬刊) ：134-135.网页链接

‘叁’ 植物多糖的结构是怎样的

植物多糖结构组成非常复杂，不同种的植物多糖的分子构成及分子量各不相同。多糖也具有一、二、三、四级结构，一级结构是指糖基的组成，糖基排列顺序，相邻糖基的连接方式；多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象；多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象。
多糖的结构单位是单糖，相同或不同的单糖以α－或β－糖苷键相连接，结构单位可以连成直链，也可以形成支链，自然界许多动植物和微生物多糖的基本结构单元是葡聚糖。

‘肆’ 多糖类的分析方法

下面将简单介绍化学方法和物理分析方法。⑴化学方法测定多糖结构还是目前最常用的方法，测定的手段很多，其中经典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙酰解和甲醇解等。① 乙酰解：多糖的乙酰解反应是在由乙酸酐、乙酸和硫酸组成的混合液中加热进行的，在一定的糖苷键处裂解。研究表明，相同糖苷键在酸水解和乙酰解中的速度是不同的。乙酰解是酸水解的一种有用的补充，多糖可从这两种不同的方法中获得不同的片段，从不同的角度获得多糖的结构信息。甲醇解：多糖在80-100℃条件下与无水甲醇氯化氢反应能将多糖变成组成单糖的甲基糖苷，这些甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，然后进行GC分析并与标准单糖对照，可得到组成多糖的各单糖的定量数据。⑵物理分析法 ①IR法：IR在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型，以及常规观察其他官能团。一般主要观察730-960cm-1的范围，如对于α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有最大吸收峰。②MS、GC-MS：GC分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但GC-MS是多糖结构分析不可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖及甲基化寡糖的分析，而且能鉴别出糖的异构体。MS在多糖结构分析中不仅在鉴别各种甲基衍生物的碎片，确定各种单糖残基的连接位置时必不可少，而且由于FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技术的出现，利用质谱还可以测定多糖的分子量及一级结构。③NMR：用NMR技术研究多糖结构的一个特点是不破坏样品，对多糖的结构特征可通过化学位移、偶合常数、积分面积、NOE及驰豫时间等参数来表达。一维、二维图谱 NMR在分析糖的构型、相互连接的位置及顺序等方面具有广阔的应用前景。2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特点，近年来发现这些生物大分子的某一分子量范围成分具有药理活性，而另一分子量范围的成分不具有药理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是这类药物的有效性控制的指标又是安全性控制的指标，质量标准中制订该项检查十分必要，这也是近年来大分子聚合物药物质量标准发展的一个明显的特点。多糖分子量只是代表相似链长的平均配布，不同方法所测得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量与数均分子量也相差较大，通常采用凝胶色谱法控制这类药物的分子量及其分布，应经研究选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂；使用的流动相通常为水或缓冲液，其pH值不应超过填充剂的耐受范围，可加入适量的有机溶剂，但浓度不应超过30%，流速以 0.5-1.0ml/min为宜，因这类分子多无紫外吸收，一般采用示差折光检测器，选用对照品的分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配，测定数据经适宜的GPC软件处理求得相关参数。3、含量测定一般来讲，多糖不含蛋白和氨基酸，蛋白或氨基酸检测应呈阴性或符合限度检查要求，如为糖蛋白或糖肽，应提供其证据，以保证产品不是多糖与蛋白的混合物；并提供其氨基酸构成及蛋白含量范围，以保证质量稳定可控。对从天然植物中得到的多糖，在结构研究中尤其对糖组成分析，确定其中是否含有糖醛酸残基具有很重要的意义。糖醛酸的含量测定目前较常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖残基的干扰。为了消除测定的干扰，可先测定样品中中性糖的吸收度，然后从样品的吸收度减去中性糖的吸收度，即为样品中糖醛酸的吸收度值。间羟基联苯法也是一种常用的多糖中糖醛酸含量测定方法，该法较硫酸咔唑法受中性糖残基的干扰更小。多糖的含量测定可分为两大类：一类是直接测定多糖本身，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的纯品和特定的酶，后者测定时方法学干扰较大，现有的比色重现性差，受影响因素多。但由于目前国内的实验条件，多糖的含量仍然主要采用这种方法，其原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量，所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量而不是总多糖的含量，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的含量，即为总多糖的含量。另外还可以采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法），它是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。

‘伍’ 怎么提取植物的多糖

植物活性多糖的提取方法有多种,在水提醇沉的基础上,常采用酶解、微波、超声波,膜处理和CO<2>超临界萃取等方法进行辅助提取或精制.最常用的还是水提醇沉法.
举例: 蒽酮比色法，具体步骤
一、仪器、试剂和材料

1.仪器：电子天平，超声波清洗器，电热恒温水浴锅，抽滤设备，分光光度计，容量瓶，刻度吸管等

2.试剂：

(1)葡萄糖标准液：l00 µg/mL

(2)浓硫酸

(3)蒽酮试剂：0.2 g蒽酮溶于100 mL浓 H2SO4中。当日配制使用。

3.材料：甜高粱，甘草

二.操作步骤

1.葡萄糖标准曲线的制作

取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：

管号
1
2
3
4
5
6
7

葡萄糖标准液（mL）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.8

蒸馏水（mL）
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.4
0.2

葡萄糖含量（µg）
0
10
20
30
40
60
80

在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴沸腾起计时，准确煮沸l0 min，取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量（µg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。

2.植物样品中可溶性糖的提取：将样品粉碎，105 ºC烘干至恒重，精确称取1~5 g，置于50mL三角瓶中，加沸水25mL，加盖，超声提取10 min，冷却后过滤（抽滤），残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤（抽滤），滤液收集在50mL容量瓶中，定容至刻度，得可溶性糖的提取液。

3.稀释：吸取提取液2mL，置于另一50mL容量瓶中，以蒸馏水定容，摇匀。

4.测定：吸取1 mL已稀释的提取液于试管中，加入4.0 mL蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水替代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（µg）。

三、结果处理：

C × V总 × D

样品含糖量（%）= ————————————— × 100%

W × V测 × 106

其中：C——在标准曲线上查出的糖含量（µg），

V总——提取液总体积（mL），

V测——测定时取用体积（mL），

D——稀释倍数，

W——样品重量（g），

106——样品重量单位由g换算成µg的倍数