bliss是什么方法

① LD50的测定

LD50的测定方法很多，如:目测机率单位法、加权机率单位法(Bliss氏法)、寇氏法(Karber氏法)及序贯法等，其中Bliss法是比较推荐使用的方法。此法对剂量分组无严格要求，不需要剂量组有0%和100%死亡率，是目前公认最准确的测定方法。但本法计算繁琐，故现多采用计算机程序计算。

我国卫生部规定，Bliss法是作为新药LD50测定评定必须采用的方法。

(1)bliss是什么方法扩展阅读

在毒理学中，半数致死量（median lethal dose），简称LD50（即Lethal Dose, 50%），是描述有毒物质或辐射的毒性的常用指标。按照医学主题词表（MeSH）的定义，LD50是指“能杀死一半试验总体的有害物质、有毒物质或游离辐射的剂量”。这测试最先由J.W. Trevan于1927年发明。

定义

半数致死量（lethal dose 50%, LD50）：是指能够引起试验动物一半死亡的药物剂量，通常用药物致死剂量的对数值表示。

LD50及相应置信区间是由剂量-反应模型得出的最常用的统计量。

LD50是半数致死剂量，指在预定时间之内，如96h，导致50%被暴露个体死亡的剂量。

半数致死剂量

指使实验动物一次染毒后，在既定实验期间和条件下统计学上半数实验动物死亡所使用的毒物剂量。

LD为Lethal dose(致死剂量)的缩写

LD50是半数致死剂量，指使实验动物一次染毒后，在14天内有半数实验动物死亡所使用的毒物剂量。特别提示，LD50中50为下角标。

LD50=0.1mg/kg 表示在一次性摄入0.1mg*BW(体重)剂量的毒性物质后，14天内导致一半被测动物死亡。

② 简述信息组织的思想方法

信息组织即信息的有序化与优质化，也就是利用一定的科学规则和方法，通过对信息外在特征和内容特征的表征和排序，实现无序信息流向有序信息流的转换，从而使信息集合达到科学组合实现有效流通，促进用户对信息的有效获取和利用。 信息组织具有：类聚性，系统性，动态性，多重性，综合性。
（1）信息选择：从采集到的、处于无序状态的信息流中甄别出有用的信息，剔除无用的信息，是信息组织过程的第一步。 （2）信息分析：按照一定的逻辑关系从语法、语义和语用上对选择过的信息内、外特征进行细化、挖掘、加工整理并归类的信息活动。 （3）信息描述与揭示：也称为信息资源描述，根据信息组织和检索的需要，对信息资源的主题内容、形式特征、物质形态等进行分析、选择、记录的活动。 （4）信息存贮：将经过加工整理序化后的信息按照一定的格式和顺序存贮在特定的载体中的一种信息活动。 [编辑]
编辑本段信息组织的类型
1、按信息表现形式划分
（1）文字信息组织 （2）图像信息组织 （3）声音信息组织 （4）视频信息组织
2、按信息的加工程度划分
（1）一次信息组织 （2）二次信息组织 （3）三次信息组织
3、按信息的传播载体划分
（1）文献信息源 （2）非文献信息源 非文献信息源特指网络环境下没有以传统文献载体形式出现的信息源，如程序代码、网页、超文本等。为了学习的方便，我们统称为网络信息源。
（1）信息组织的渗透性
信息组织的渗透性指信息组织存在于各种信息揭示、存贮和检索活动之中。
（2）信息组织的依附性
信息组织的依附性指信息组织无法独立存在，它要以信息的识别、揭示等活动为前提。
（3）信息组织的增效性
信息组织的增效性指信息组织可以增加信息传播、检索、利用的效率，是其他信息加工活动和利用信息的保障。
编辑本段信息组织的原则
1.客观性原则
信息组织中进行描述和揭示的基本依据就是信息本身（the item obtained），因此，我们描述和揭示信息的外在特征和内容特征必须客观而准确，要根据信息本身所反映的各种特征加以科学地反映和序化，形成相应的信息组织的成果。
2.系统性原则
系统性原则要求在信息组织中把握好这四个关系： （1）宏观信息组织与微观信息组织的关系 （2）信息组织部门与其他部门的关系 （3）信息组织工作各个环节之间的关系 （4）不同信息处理方法之间的关系
3.目的性原则
信息组织具有鲜明的目的性，必须围绕用户的信息需求开展工作，注意信息机构的目标市场的需求状态及其变化特征，满足成本收益对称的原则。
4.现代化原则
信息组织现代化原则包括思想观念现代化和技术手段现代化两个方面。 信息组织的思想观念现代化集中体现在信息组织的标准化上，即信息组织工作的一致性、信息组织方法的规范性、信息组织系统的兼容性和信息组织成果的通用性。
编辑本段信息组织的要求
(1) 信息特征有序化。
一是要将内容或外在特征相同或者相关的信息集中在一起，把无关的信息区别开来；二是集中在一起的信息要有系统、有条理，按一定标识呈现某种秩序，并能表达某种意义；三是相关信息单元之间的关系要明确化，并能产生某种关联性，或者能给人某种新的启示。
(2) 信息流向明确化。
现代管理科学的基本原理表明，信息作用力的大小取决于信息流动的方向。信息整序要做到信息流向明确化。首先，要认真研究用户的信息需求和信息行为，按照不同用户的信息活动特征确定信息的传递方向；其次，要注意根据信息环境的发展变化不断调整信息流动的方向，尽量形成信息合力。
(3) 信息流速适度化。
信息流速的不断加快使人们感受到巨大的信息压力，眼花缭乱的信息流可能会降低决策的效率。同时，人们面对的决策问题在不断地发展变化，信息需要也在不断地更新。为此必须适当控制信息流动速度，把握信息传递时机，提高信息的效用。
编辑本段信息组织的目的
信息组织的目的可以概括为“实现无序信息向有序信息的转换”。具体地说，信息组织的目的应包括： ①减少社会信息流的混乱程度； ②提高信息产品的质量和价值； ③建立信息产品与用户的联④节省社会信息活动的总成本。
编辑本段信息组织的理论基础
信息组织是由来已久的一种人类社会实践活动，在其发展过程中，不断地从相关学科的理论和方法中汲取营养，使自身逐渐得到充实和完善。 （1）系统理论 系统科学的思想是20世纪20年代由奥地利学者路得维希.冯.贝塔朗菲（Ludwig Von Bertalanffy）在研究理论生物学的时候提出来的，他把系统定义为“相互作用的诸要素的复合体”，认为系统是处于一定的相互关系中并与环境发生关系的各个组成部分的总体。系统具有整体性、内部相关性、环境相关性、层次性、有序性、目的性等特征。信息组织使信息有序化，使有组织的信息整体功能大于各个信息单元的功能之和。 （2）耗散结构理论 耗散结构理论由比利时布鲁塞尔学派领导人伊利亚.普里高津（Ilya Prigogine）提出。其基本思想有两点：一是系统内部非平衡是有序之源；二是开放系统通过与外界交换物质、能量而增加、维持有序性。信息组织通过与外界交换物质、能量与信息，对信息整序加工使信息系统成为远离平衡态的开放系统。因此，耗散结构理论可作为信息组织的理论基础。 （3）协同性理论 协同性由德国科学家哈肯（Haken）于1970年提出，是一门研究系统进化普遍规律的科学，它研究由许多子系统构成的系统是如何通过协作从无序到有序演化的规律。由于信息由许多信息单元构成，如何建立各个信息单元之间的协同作用机制，使信息由无序向有序转化是信息组织的基本目标。 （4）突变理论 突变理论由法国数学家托姆（R. Thom）提出，它用形象而精确的数学模型来揭示和预测事物的连续性中断的质变过程。突变理论的一个重要观点是“突变是产生有序性的重要源泉”。突变理论为信息组织理论的发展与完善提供了理论基础。 （5）知识组织理论 知识组织理论最早由英国着名的分类法学家布利斯（Bliss）提出。所谓知识组织，是指对知识客体进行诸如整理、加工、揭示、控制等一系列组织化过程，是关于知识组织的理论与方法。知识组织可分为主观知识的组织和客观知识的组织。主观知识的组织在人的大脑中进行，表现为复杂的神经生理活动，人工智能、认知心理学等重点研究主观知识组织的内在机理；客观知识的组织是通过人的认知进行分类，并凭借一定的方法完成的。信息组织主要关注客观知识的组织活动。 （6）信息自组织理论 信息自组织是信息组织方法的拓展，是信息组织理论研究中的新课题。不借助外部控制而能实现从无序到有序的转变，并维持稳定有序状态的系统称为自组织系统。信息自组织是指作为信息系统组成要素的信息，由于人与人之间、人与系统其他要素之间存在的相关性、协同性和默契性而形成特定结构与功能的过程，也就是信息系统无需外界指令而能自行组织信息，自我有序化和优化的过程。近年来，信息总量的持续增长、信息技术的飞速发展，使信息系统显着地具备了自组织的条件，特别是网络信息已经具有自组织的开放性、远离平衡和非线性相关等特征。因此，研究信息自组织理论对于网络信息的组织具有非常重要的理论与实践意义。
编辑本段图书信息
第三节 分类标引的方法与规则 一、辨类的方法 二、分类标引的基本规则 三、分类标引的一般规则 四、各学科信息的分类标引规则 五、确定分类法使用本与图书改编 六、同类书区分 第四节 主题标引的方法与规则 一、主题概念分解与查表选词的方法 二、选择标引词的一般规则 三、各类型主题与各类型文献的主题标引规则
第七章 信息组织中的自然语言应用
第一节 自然语言在信息组织中的应用概述 一、自然语言的演化 二、自然语言区别于受控语言的特点 三、自然语言处理及其在信息组织和检索中的应用 第二节 自然语言在信息组织中的应用 一、自动标引的实现基础——自动分词 二、自然语言标引 三、自动分类 第三节 自然语言检索系统与自然语言检索 一、自然语言检索系统概述 二、自然语言检索 三、全文检索 四、搜索引擎的自然语言检索 五、自然语言检索系统的优点及存在的不足 第四节 后控制检索 一、后控制机制概述 二、国内外后控词表研究及其应用现状 三、网络检索系统中的后控制技术
第八章网络信息组织
第一节 网络信息类型与特点 一、网络信息及其类型 二、网络信息的环境特点和组织的难点 三、网络信息组织的目标 第二节 网络信息的分类组织 一、传统分类法应用于网络信息组织 二、网络信息分类法与分类模式 三、网络信息自动分类 第三节 网络信息的主题组织 一、基于网络的叙词表的发展 二、叙词表在网络多媒体信息组织中的应用 三、主题法在网关中的应用 第四节 基于本体的信息组织 一、语义网信息组织新模式 二、本体基本原理 三、网络本体描述语言 四、本体构造 五、本体标注 第五节 网络信息组织方式 一、文件方式 二、数据库方式 三、主题树方式 四、搜索引擎方式 五、Web2.0信息自组织方式 第六节 网络信息重组与知识挖掘 一、网络信息重组与导航 二、网络知识挖掘

③ 小鼠灌胃 处死 解剖

目的：观察“酒花素油剂”小鼠口服和大鼠皮肤用药的毒性反应。方法：小鼠灌胃给予不同浓度的“酒花素油剂”(各剂量间比值为0.85)，观察死亡情况，用Bliss法计算LD 50 。大鼠背部脱毛，涂以不同浓度的“酒花素油剂”，涂药面积约占体表面积的10%，破损皮肤组用针尖划破表皮。给药后观察大鼠的体重及中毒反应。结果：小鼠口服“酒花素油剂”后的LD 50 为557.06 mg/kg，中毒表现主要为肢体抽搐和呼吸困难。大鼠完整皮肤对浓度为临床用浓度10倍的“酒花素油剂”能较好耐受，破损皮肤对7倍于临床用浓度的“酒花素油剂”亦能较好耐受。结论：“酒花素油剂”口服为低毒性物质，完整皮肤和破损皮肤用药均较为安全。

“酒花素油剂”为上海华光啤酒厂生产的，用于促进慢性疮疡及烧伤创口等愈合的外用制剂。为了考察“酒花素油剂”的安全性，本文拟观察“酒花素油剂”一次给予小鼠口服后所产生的毒性反应及死亡情况，并观察完整皮肤及破损皮肤的大鼠在短期内接触“酒花素油剂”后所产生的毒性反应。

1 材料

1.1 动物：昆明种小鼠，体重18～22 g，雌雄各半；SD大鼠，体重170～230 g，雌雄各半，由第二军医大学实验动物中心提供。

1.2 药品：“酒花素”及中性植物油(溶剂)由华光啤酒厂提供。根据实验要求，将“酒花素”溶于中性植物油中，配制成不同浓度的“酒花素油剂”。

2 实验方法

2.1 小鼠口服LD50〔1〕

根据预试结果，在药物剂量为366～970 mg/kg的范围内，将小鼠按体重均匀分为7组，每组10只(�♀各5只)，各剂量间距为0.85，灌胃给药体积为每10 g体重0.1 ml。另设一溶剂对照组，仅给中性植物油0.8 ml/只。

小鼠禁食12小时后灌胃给药，给药后即开始观察动物的毒性反应情况，及时记录死亡数。死亡动物立即进行解剖，观察内脏器官的病变情况。未死动物连续观察9天，9天后处死，解剖，观察脏器变化。

用Bliss法计算LD 50 ，采用计算机“NDST程序”进行运算。

2.2 大鼠皮肤急性毒性实验〔2〕

实验动物分为完整皮肤和破损皮肤两部分，每个部分又分为大、中、小三个剂量组，剂量间距为0.7，每组10只大鼠。另设溶剂对照组，每组6只大鼠。

大鼠在氯胺酮(90 mg/kg ip)麻醉下，进行背部脱毛(用剃刀仔细剪去背部的毛)，脱毛范围约为4.5 cm×7 cm(约占体表面的10%左右)。在此脱毛区内均匀涂以不同浓度的“酒花素油剂”及溶剂，约0.6 ml/只，涂完后用无毒塑料薄膜覆盖，绷带包扎。破损皮肤组大鼠在背部脱毛区用针尖划破表皮，以渗血为度，然后再涂以不同浓度的“酒花素油剂”。给药后即开始观察动物的全身毒性反应，死亡动物立即进行尸体解剖，肉眼观察各脏器的病变情况，10天后处死大鼠，大体解剖，肉眼观察全身各器官的变化情况。

3 结果

3.1 小鼠口服LD 50

小鼠灌胃给药后，死亡动物约在0.5～2小时内出现呼吸急促、烦躁等表现，随后出现肢体抽搐，死亡前有明显的惊厥表现。死亡一般发生在给药后的1～6小时内，个别发生在12～48小是内。死后立即尸检可见，小鼠因死前的肌肉强直而表现为尸体僵硬，心脏停跳于收缩状态。内脏重要器官(心、肺、肝、脾、肾及消化道等)未见充血、水肿及明显的器质性变化。存活动物多数有一过性的呼吸急促表现，24小时内活动稍差，食欲减少。24小时(个别48小时)后逐渐恢复活动和摄食，一般情况良好，无其他不良反应的表现发生。连续观察9天后处死小鼠，大体解剖未见肉眼可见的病理变化。溶剂对照组10只小鼠给药后无明显的毒性反应出现，观察10天后处死，大体解剖亦无异常发现。

各剂量组的死亡情况见表1，死亡率无明显的性别差异。

用Bliss法计算得LD 50 =577.06 mg/kg,95%可信限范围为505.74～658.43 mg/kg。

3.2 大鼠皮肤急性毒性实验

各剂量组大鼠的死亡情况及给药前后的体重变化情况见表2。

表1 小鼠口服“酒花素油剂”后LD 50 计算(Bliss法)

剂量(mg/kg)
对数剂量(X)
动物数(只)
死亡动物数(只)
死亡率(%)
机率单位(Y)

970
2.987
10
10
100
6.75

824
2.916
10
8
80
6.20

701
2.846
10
7
70
5.66

596
2.775
10
6
60
5.11

506
2.704
10
4
40
4.56

430
2.633
10
2
20
4.01

366
2.563
10
0
0
3.46

表2 大鼠皮肤用“酒花素油剂”后的毒性反应

组
别
药物浓度(%)
动物数(只)
死亡动物数(只)
体重 (g,x±s)

用药前 用药后
完
整
皮
肤
A
53.67
10
0
206±19
210±24

B
37.57
10
0
207±21
220±20

D
溶剂
6
0
198±19
206±22

破
损
皮
肤
A
53.67
10
2
200±20
204±23

B
37.57
10
0
202±18
207±21

C
26.30
10
0
198±19
199±24

D
溶剂
6
0
206±22
208±20

在完整皮肤的大鼠中，两个用药组及溶剂对照组均无明显的毒性表现，用药后饮食、活动无明显变化。各组动物给药局部均未发现明显的红、肿等刺激反应，1周后脱毛区开始长毛。连续观察10天后处死大鼠，大体解剖未见明显的脏器异常变化。

破损皮肤大鼠用药后，大剂量组在4～24小时内有2只死亡，死前出现明显的呼吸困难及轻度肌肉抽搐，死后尸体解剖无明显的异常发现。另有两只大剂量组及1只中剂量组的大鼠在用药后8～12小时内出现一过性的呼吸困难。其余各用药组及溶剂对照组的大鼠均未见明显的毒性反应，仅少数动物在用药当天食欲稍差。连续观察10天，大鼠饮食、活动均无异常，体重变化亦不明显。大鼠皮肤破损区创口第二天开始结痂，无明显的红肿及溃烂表现，亦无感染发生。创口约1周左右愈合，无明显疤痕。观察10天，部分大鼠脱毛局部已开始长毛，10天后处死，大体解剖未发现肉眼可见的异常变化。

4 讨论

酒花素是从啤酒花中提取的有效成分，主要由蛇麻酮、草酮等组成。已有的研究资料表明，酒花素有一定的抗菌和促进肉芽组织增生的作用。本实验的结果显示，大鼠在用药面积占体表面积10%的情况下，破损皮肤对浓度为26.30%的“酒花素油剂”能较好耐受，对37.57%的浓度亦能耐受，且破损皮肤创口愈合较快，无感染发生。该两浓度分别为临床用药浓度的5倍和7倍(临床用药浓度为5%)。完整皮肤对于临床用药浓度10倍剂量的“酒花素油剂”亦能耐受，不出现明显的中毒反应。作为溶剂的中性植物油用在破损皮肤和完整皮肤上均无明显的毒性反应。小鼠口服该药的LD 50 为577.06 mg/kg，属低毒物质。以上结果提示，“酒花素油剂”临床应用较为安全。

④ IL-2活性测定问题

实验前应明确的问题

1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。

7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤

贴壁细胞：

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5.终止培养，小心吸去孔内培养液。

6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

悬浮细胞：

1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100(储存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

MTT的配制

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

配制MTT时用用PBS<ph=7.4>溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方:

Nacl 8g

Kcl 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

调ph 7.4

定容1L

关于细胞的接种(铺板)

细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。

接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。

细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.

其它的声音：

1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。

2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。

3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.

注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。

首先说说我的一点经验：

1.吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。。。

2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益

3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。

4.吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30－50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）

5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。

加入MTT

个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些

MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。如果不使用96孔板，培养基超过100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。

如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性极大,另外MTT稀释后加入细胞前还是需要以过滤的方式灭菌为宜.且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的

因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。

如何清除上清

百家争鸣：

1.加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。

2.我每次将MTT加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心1000G,5min。但是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧！

3.另外，可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。

4.做MTT时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响OD值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。

5.加完MTT反应3－4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶,使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。

6.用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶.

避免清除上清而改进的方法

由于一般可离心96孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做MTT时，用DMSO溶解得到结果也不好，不是得不到预期结果就是可重复性差。

解决方法1:用以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457

具体方法：

配三联溶解液：10%SDS，5%异丁醇，0.012mol/LHCL，蒸馏水溶解。

三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液

操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液，90ul／孔；如需给药，则再于同时(悬浮细胞)或4h后(贴壁细胞)加入不同浓度的药物10ul／孔，均设三复孔。另外，每块板上另没一个调零孔(只加培养液，不含细胞和药物)。培养2d后，加入MTT溶液20ul／孔，继续培养4h，然后加入上述三联液100ul／孔，于37度放置过夜后，用酶标仪测各孔A570值。

优点：简化操作，提高了可靠性。

解决方法2：日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂， CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST–8[其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。

★优 点

1、简 便 只需一步即可得到结果

2、省 时 毋需预制，即开即用

3、安 全 毋需放射性同位素和有机溶剂

4、快 速 省去了溶解除沉操作

5、灵敏度高 灵敏度高于MTT

6、重现性好 步骤少；无损失；结果准确

就是比较贵，如果经费充足，用这个是不错的。

★进行细胞增殖分析的使用方法:

1、接种细胞悬液100μl于96孔板内，预先置于37℃，5% CO 2饱和湿度培养箱内培养。

2、在每个孔内加入10μl的CCK-8试剂。

3、把培养板放在培养箱内培养1-4小时*。

4、在450nm波长处测定吸光度，参比波长为600nm或600nm以上。

解决方法3：使用MTS

解决方法4：

加入DMSO

在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到,会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.

1.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信.

2.加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。

3.或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。

振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡96孔板有专的振荡器，目的:扎破气泡.有气泡存在时,由于其对光的反射与折射作用(酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度),会导致结果偏移.

OD值的测定

至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO，它的测定波长是570。(就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选用TMB显色液则用450);而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。

DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而SDS做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变.

细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。

复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15，差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000－10000个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间：18－24h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。

一般为了实验的准确，每个浓度可以设5－6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1－4小时）等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！(一般开机预热20min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之间误差较小。这和分析化学中的lambert-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。

在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。

其它的声音：

1.最好用570nm波长的滤光片，因为MTT在这个波长的吸光度是峰值，换句话说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是490nm，但我的经验灵敏度降低一半。

2.我们用的BIO-TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差. 我曾经看到园子的有些帖子报道说OD值大概在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系，但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳，若你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。

边缘效应

96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低,96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，由于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。解决方法:将孔板周围的一圈孔全部不用，影响非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培养液，只要能防止蒸发就可以.

关于如何计算IC50

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入

计算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025

(2)Bliss法:自己查阅书籍

(3)IC50计算软件，见下面附件

（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！

（5）在线求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

结果统计学处理

所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显着，p<0.01时为相差非常显着。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组

excel表中可以做两两比较的T-test,这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。

孔板的重复利用:

培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过3次,底值最好在测得值的1/3一下。

强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一,则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.

重复利用时

做法1：

洗净后用2％NaoH浸泡4小时，再用1％稀盐酸浸泡4小时，冲洗15遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干，UV照射过夜(紫外2小时以上消毒即可)

做法2:

泡酸2－4小时，老师让我们别超过4小时，（普通的玻璃仪器是过夜）。捞出，冲洗干净，烘干后，UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起，钴60照射消毒.

做法3:

1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。

做法4:

1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超10-30分钟，晾干(或烘干)备用。

此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。

2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%)，我一般加60ul，加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内(胰酶在37度时的活力最大)。

对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。

3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干(或烘干)备用。

如果不烘干就泡酸，那么96孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。

4、将晾干的96孔板泡酸(中强酸)过夜，捞起后自来水下冲洗10遍；双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的OD值的测定。

5、做实验前，96孔板至少在紫外灯下照射30分钟，但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。

注：

1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。

2、96孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值(此值为初值)，实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。