生物制品分析方法验证

① 建立生物样品分析方法，对定量分析方法进行验证包括哪些内容

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生物样品定量分析方法验证指导原则
1.
范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。
2.
生物分析方法验证
2.1
分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。

② 无菌检验方法验证

无菌检查 方法 是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随我一起来了解下吧！

无菌检验方法验证

无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。

前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。

再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。

通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。

前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。

供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。

(一)具体的验证方法如下：

1. 菌种的选择

无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 [CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌 [CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌 [CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。

2. 菌液的制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28 ℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

3. 样品的前处理

无菌产品中每个成分应该是均匀的，因此只要确定在验证的方法中，按所需的总接种量即可，而不必像样品日常检测中按规定的容器数取样。

如果制备样品时需要使用溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等溶剂，需要确保这些溶剂是有效的，并且其使用对微生物生长无影响;或者制备过程中需要对样品进行加热助溶、离心等操作时，需要确保加热的温度、离心速度和离心时间等对微生物生长或分布无影响。 不需前处理的样品免做。

(二)消除样品抑菌性的方法

无抑菌性样品的验证方法：依据产品溶解性和微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释，用直接接种法验证，常用中性稀释液或淋洗液。

对于具有抑菌性样品的验证方法，首先确定样品的抑菌作用(抑细菌、真菌试验验证)，选择敏感标准菌株对供试品抑菌活性去除效果检查(阳性菌回收试验)。 常用的消除样品抑菌活性的方法如下：

1. 稀释法：利用降低供试品的相对浓度，将样品稀释至最低抑菌浓度下进行。如：取规定量的样品溶液至较大量的培养基中，使单位体积内的样品含量减少，至不含抑菌作用。

2. 薄膜过滤法：利用体积差异分离，通过薄膜过滤，微生物被截于滤膜，培养薄膜观察有无微生物生长。通常薄膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50?mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。滤器和滤膜在使用前采用适宜的方法进行灭菌。使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 供试液经过滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100?ml。总冲洗量不得超过1000ml。

3. 化学中和法：利用化学(生物)专属性灭活，常用中和剂或灭活方法有：对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。对化学中和剂不敏感的样品，用酶中和，如β -内酰胺酶。

4. 联合使用：将以上两种或几种方法组合运用，以消除样品的抑菌性。适用于抑菌作用较强的中西药制剂。

5. 其次按照以下要求制备3组样品：

样品组：选择以上适当的方法中和样品，加入少量验证微生物(接种量少于100cfu)。

对照组：0.1%蛋白胨或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,加少量微生物(接种量少于100cfu)。

阳性对照组：将试验菌株直接接种于培养基中(接种量少于100cfu)。

6. 最后结果分析如下：

样品组与对照组微生物生长数量相似，表明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性(即有效性)，如果对照组与阳性对照组的微生物数量相似，表明样品预处理、消除样品抑菌性的方法、检测程序和培养条件等均不影响微生物生长(即无毒性)。样品如无抑菌性，省去对照组试验，样品组与阳性对照组直接比较。样品组微生物生长数量不及阳性对照组微生物生长数量，表明样品的预处理、试验用器具材料、培养条件等方面存在对微生物生长不利的因素。

(三) 为考查验证方法的稳定性和重现性，验证至少需3个不同批次的同类样品，分别进行3次验证试验。

无菌检查方法验证试验设计

薄膜过滤法：按照药典的要求取每种培养基规定接种的样品总量按薄膜过滤法过滤、冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤桶内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按照药典的要求的温度和时间进行培养。

直接接种法：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100?cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，按照药典的要求的温度和时间进行培养。

结果判断

同对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明验证通过;如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，验证失败，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂和灭活剂、更换滤膜等方法，消除供试品的抑菌作用，重新进行验证。

无菌检查的常见方法

首先要检查方法验证方案设计的科学性和完整性，是否有与药典方法相悖的地方，尤其是产品本身的抑菌性，检查方法的选择，是直接接种法还是薄膜过滤法等。

无菌检查方法验证的硬件是否具备及是否已经进行了相关的确认。如使用黑曲霉菌是否具有生物安全柜并进行确认，无菌室的确认及日常监测，培养箱的型号及数量和进行确认的情况等，智能集菌器、全封闭无菌试验过滤培养器的型号、性能，滤膜是否符合规定等。

验证中各个环节有关数据的真实性，如产品本身抑菌性试验数据，菌种回收率和培养基适用性和灵敏度检查数据，菌种的传代、销毁和使用记录，无菌检查操作记录、培养记录等。

无菌检查中偏差的处理是否真的找到了根本原因，是否在没有确切的原因前就对样品重新检查并依据新的检查结果放行产品。

验证的方法与无菌检查操作规程和无菌检查记录是否完全一致，如操作步骤、检查方法、检查环境、试验耗材均需与实际检查操作规程及验证过程完全相符。

为了考查验证方法的稳定性和重现性，验证时是否至少采用了3个不同批次的同类样品，分别进行了3次验证试验。

使用新的滤膜或过滤器(不同厂家或批号、型号)是否重新进行样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组的验证确认。

除非样品不能采用过滤的方法(难溶解)，企业是否采用全封闭的薄膜过滤法。

菌液的保存条件和保存期限是否符合药典的要求，对于黑曲霉孢子悬液是否有验证的资料。

无菌检查的注意事项

培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查。

中国药典附录中规定的检验数量不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略。

无菌检查时应强调“检验数量”，主要是保证试验结果的代表性，而阳性对照试验和验证时仅须满足“检验量”总量要求即可，以保证试验结果的可靠性，验证试验可以由此减少大量的样品;工作菌株的传代次数不得超过5代，以防止过度的传代增加菌种变异的风险。这里“代”的定义是指，活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。

菌液加入，按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑过滤器的有效性。过滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查(如检查阳性菌液通过滤筒的流出液)。

实验室菌种的处理和保存的程序应标准化，以尽可能减少菌种污染和变异。

试验时菌悬液并不是只要活的菌体就行，而是要保持旺盛的生命力，所以菌悬液存放时间不能太长。

菌液制备后若在室温下放置，应在2?h内使用，若保存在2～8℃，可在24?h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

薄膜过滤法采用大样品量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作相对简单。该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性微生物的污染，对试验结果的可信性影响较小。因此无菌试验采用薄膜过滤法还是直接接种法并不依赖于验证结果，而是取决于样品的特性，如能采用过滤的方法均应采用薄膜过滤法检查。

若样品含有抑菌成分，当采用薄膜过滤法时，应先将供试液稀释后在过滤，这样可以减少滤膜对样品的吸附，减少冲洗量，进而减少微生物的损失或伤害。

无菌检查应作为稳定性考察的项目进行，以便对产品有效期的制定和合理的确定储存条件提供重要的依据。

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③ 生物制品的无菌检查法的实验原理，准备工作及操作步骤

1. 目的：建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2. 范围：适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。3. 责任：化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。4. 定义：无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。5.内容：5. 1无菌操作设备：无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小 时。5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板：在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75％酒精棉及拖鞋等。5.2仪器、用具：5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、 三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。5.2.2用具的包扎：5.2.2.1移液管在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。5.2.2.2试管在管口塞上纱布棉塞。5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。5.2.2.4注射器洗涤干净的注射器及注射针头装配好后，放入垫有纱布的带盖容器内（饭 第3页/共7页盒）一层层放好，上面盖上纱布，然后盖上容器的盖子，用牛皮纸包好。5.2.2.5滤器 将检验合格后微孔滤膜先有水中浸泡湿润，取出后固定在细菌过滤器的滤板上，滤板下、滤膜上均用耐高温垫圈垫好，上好滤器。在灭菌前滤器的螺勿拧太紧，滤器上口用8层纱布及牛皮纸包扎，装妥后放入容器内，再将盛滤器的容器盖好盖子，用牛皮纸包扎。5.2.3用具的灭菌：将包扎好的用具，在121±0.5℃蒸汽灭菌柜中灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易致染菌，应置温箱或或加温烘干。5.3培养基、试剂：5.3.1一般采用商品干燥培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。使用前，按要求分装灭菌好的细菌培养基须经30-35℃培养48小时，真菌培养基须经20-25℃培养72小时，证明无菌生长后方可使用。 制备的需气菌、厌气菌培养基应半个月内用完，在供试品接种前，培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则须经水浴煮沸加热，只限加热一次。5.3.2革兰氏碘液：先用3-5ml蒸馏水溶解2.0g碘化钾，再加入1.0g碘片，搅拌溶解后，加蒸馏水稀释至300ml，摇匀。置密闭棕色瓶中备用。5.3.3结晶紫染色液：将结紫1.0g溶解于20ml95%乙醇中后，与80ml1%草酸铵溶液相混合，静置48小时使用。此液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。5.3.4沙黄染色液：将0.2g沙黄溶解于10ml95%乙醇中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。5.3.5生理盐水：称取9g氯化钠，加水1000ml溶解，分装后于121±0.5℃湿热灭菌30分钟。供作稀释剂用。 第4页/共7页5.3.6 75%乙醇量取无水乙醇75ml,加水稀释至100ml，摇匀，即得。5.3.7 0.1%新洁尔灭：量取5%新洁尔灭20ml，加水稀释至约1000ml，摇匀，即得。5.4培养基灵敏度检查：5.4.1新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。 (1)取藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B） 28001］的营养琼脂斜面和白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含琼脂的需气、厌气培养基新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。然后以10倍系列稀释后，制成1ml中含10-100个菌并计数。 (2)取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气、厌气培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，取接种至霉菌培养基内，20-25℃用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。 将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为12ml的需气、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。结果判定：以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。5.4.2配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周，临用前细菌和霉菌培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。5.4.3需气菌、厌气菌培养基在试管中装量高度不得少于7Cm，其指示剂氧化层不得超过培养基深度的1／5，否则须经水浴煮沸10分钟，但只限加热一次。 第5页/共7页无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的1／2。5.5对照用菌液的制备：5.5.1试验用菌种、菌种的复苏、菌种的接种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。5.5.2金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至营养肉汤培养基内，在30-35℃培养16-18小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:1065.5.3生孢梭菌菌液用接种环取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:106。5.5.4白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至真菌培养基内，在20-25℃培养24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:105。5.5.5上述制备的菌液，一般当日使用。5.6进入无菌室的操作要点：5.6.1根据试验程序,将用具物品搬入缓冲间,打开紫外光灯和空气过滤装置并使其工作1小时以上。5.6.2操作人员用肥皂水刷洗双手,关闭缓冲间紫外光灯,进入缓冲间内,关闭第一层门,用2%来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液洗双手,用消毒毛巾擦干,换上无菌衣、帽、口罩及消毒鞋。5.6.3关闭无菌室内紫外光灯，进入第二层门并将用具搬至无菌室内，关闭无菌室门。5.6.4凡进入无菌室后不应再外出取物品，因此，在每次试验中所用物品必须计划好，并准备好备用物品。从进入第一层门直至无菌室内，随操作人员的进入应喷雾2%来苏尔或0.1 %新洁尔灭溶液。5.7检查法：5.7.1无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品；后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。5.7.2操作时，应先用0.1%新洁尔灭浸泡或擦拭容器表面后，以无菌的方法取 第6页/共7页内容物。5.7.3凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。5.7.4供试品制备： 用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，盖为橡皮塞时，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取药液。按规定须稀释或灭活的供试品，可直接或将瓶内供试液抽出至灭菌玻璃容器内进行灭活处理并稀释至规定的体积和浓度；抽取瓶中内容液体时，应将供试品倒置并使针头在液面下。5.7.5直接接种法：按规定量取供试品，以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌液1ml，作阳性对照，另接种于真菌培养基5管。轻轻摇动，使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃、真菌培养基管置20-25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。5.7.6薄膜过滤法： 将微孔滤膜过滤装置、抽滤瓶、排气管与真空泵相连，真空泵可置无菌室外。取规定量供试品，按规定的方法处理后，加入0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，混合后，通过装有孔径不大于0.45μm 的薄膜过滤器，减压抽干后，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次至少100ml，取出滤膜分成3等份，分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml（抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌）。阳性对照管细菌应在培养24-48小时，真菌应在培养24-72小时有菌生长。5.8结果判断： 第7页/共7页当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。6 培训6.1 培训对象：化验员。6.2 培训时间：二小时。7 记录 记录名称 保存部门 保存时间 无菌检验记录 质监科 药品有效期后一年 QF-01-007-00无 菌 检 验 记 录品 名： 批 号： 规 格： 检验日期： 年 月 日培养基名称需气、厌气菌培养基真菌培养基培养培养温度30—35℃20—25℃培养时间管 号1234512345培养天数及结果1234567结 论备 注 复核人： 检验人：

④ 生物制品特殊杂质检测方法

特殊杂质检查：

利用药物和杂质在物理性质上的差异。

硫酸奎宁中“氯仿-乙醇中不溶物”的检查盐酸吗啡中“其它生物碱”的检查旋光性的差异：用于硫酸阿托品中“莨菪碱”的检查对光选择性吸收的差异：利血平生产或储存过程中，光照和有氧存在下均易氧化变质，氧化产物发出荧光。因此规定：供试品置紫外光灯（365nm）下检视，不得显明显荧光。

吸附性质的差异：硫酸奎宁制备过程中可能存在“其它金鸡纳碱”。利用吸附性质的差异，采用硅胶G薄层进行检查。规定限度为0.5%.利用药物和杂质和化学性质上的差异。

与一定试剂反应产生沉淀硫酸阿托品制备过程中可能带入（如莨菪碱、颠茄碱）杂质，因此需要检查“其它生物碱”。利用其它生物碱碱性弱于阿托品的性质，取供试品的盐酸水溶液，加入氨试液，立即游离，发生浑浊。规定0.25g药物中不得发生浑浊。

⑤ 如果怀疑实验使用的试剂可能含有被测物，应采用什么方法检验，如何进行

这类方法的变异较大、迁移或产生特定的化学物质等生物学测定常用方法 生物学测定系指采用生物学方法。这类方法的变异相对较小、辅酶、激酶，以反映被测物的生物学特性为目的的测定方法。以下为生物学测定常用方法。主要用于酶、结合试验 是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫结合试验。目前主要用于生物制品的鉴别。由于在结合试验中测定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品的活性（或效力）测定。这类方法的变异也相对较小，如动物保护力试验，一般用于疫苗的效力测定。由于动物实验的成本高。 （四）、动物试验 是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验方法、分化、死亡。对于某些治疗用的制品，由于其作用机理或本身化学性质的原因，难以建立体外测活的方法，也可以采用动物试验方法测定，但由于这类方法的变异一般相对较大，且方法的变异一般较大，为更好控制产品质量，必要时需同时采用多种方法进行测定、周期长和变异大。与上述两类方法相比。与使用传代细胞相比、抑制剂等的活性测定。 （三）、细胞测定试验 是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集，根据具体情况，在产品的常规质控时可采用其中的一种或几种，结果比较准确。 （二），使用原代细胞的方法变异更大，所以一般仅用于成品检定、激活剂。 （一）、酶反应试验 是指在体外能促进酶分子的活化或本身具备酶的活性，通过底物的变化检测酶活性。鉴于一种测定方法仅能反映制品某一方面的特性。细胞测定试验一般能较好地反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定

⑥ 生物样品分析方法验证应包含哪些内容，如何验证及评价

那要看是哪一类的生物样品，主要风险控制在于哪个方向。 一般要根据样品的种类，所要测定的成份，来确定使用什么药品什么测定方法。 对于植物主要是重金属和农残，铅砷铬镉铜和DDt，666等 对于动物主要是抗生素、寄生虫药等兽药残留和激素等

⑦ 方法验证要做哪些内容

验证内容:准确度、精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。

一、准确度:是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度,一般以百分回收率表示。至少用9次测定结果进行评价。

二、精密度:是指在规定的条件下,同一个均匀样品,经过多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

1、重复性:相同条件下,一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。至少9次。

2、中间精密度:一个实验室,不同时间不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。

3、重现性:不同实验室,不同分析人员测定结果的精密度。分析方法被法定标准采用应进行重现性试验。

三、专属性:指在其他成分可能存在的情况下,采用的方法能准确测定出被测物的特性,用于复杂样品分析时相互干扰的程度。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法,均应考察专属性。

四、检测限:指试样中被测物能被检测出的最低量,无须定量。用百分数、ppm或 ppb 表示。

五、定量限:指样品中被测物能被定量测定的最低量,测定结果应具一定的精密度和准确度。

六、线性:系指在设计的范围内,测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

七、范围:能达到一定的精密度、准确度和线性的条件下,测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

八、耐用性:指在一定的测定条件稍有变动时,测定结果不受影响的承受程度。方法验证内容如下。

方法验证包括：基本信息、原始测试数据、方法验证数据汇总、法验证结论。

1.方法学验证是对测定方法的评价，是建立新方法的研究内容和依据(新建方法已建方法的修订验证已建方法的复现)。验证类型：全部验证、部分验证、交叉验证。

2.分析方法验证步骤验证方案的制订验证目的、方法改进背景、提供的原料药和产品、仪器概要、试剂、对照品待验证的方法，项目，合格标准实施人员的培训参考文献验证的实施收集完整的验证过程记录和原始图谱复核验证报告评价该方法是否通过验证。