猪瘟病毒E2蛋白分析液相方法

1. 猪瘟的治疗

简介
在欧洲称为古典猪瘟{classical swine fever．CSF），是由猪瘟病毒（HCV或CSFV)引起的一种高度接触性传染病，猪是该病毒唯一的自然宿主。于1833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，中国《动物防疫法》将其列为一类传染病．是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想．应用组织培养弱毒苗也发生免疫失败，究其原因比较多。由于猪瘟造成的经济损失巨大．历来是各国研究的热点。
csFV基因结构与功能的研究
CSFV为有囊膜病毒，40--60 nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约1 2 3 kb，仅含有一个大的开放性阅读框架（ORF）．此ORF翻译成含3898个氨基酸残基．分子量约438 kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白．cSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码。ORF两侧是5’一端非翻译区（5’-UTR）和3’一端非翻译区（3’-UTR）．且5’一端无帽子结构．3’一端无poly(A）尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下．加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80），除c、E0、E1和E2为结构蛋白外．其余均为非结构蛋白。
目前已经定位的CSFV蛋白有5种，即 Npro、c、Erns(E0）、E1和E2．它们均由CSFV的 RNA-ORF5’一端所编码。在结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是EO和E2。
1.1 c，是病毒的衣壳蛋白，也称p14，由病毒ORF中的Setl 69～Al a267组成．是 CSFV核衣壳蛋白其N端由CSFV非结构蛋白p23的水解作用产生，c端可能是由宿主细胞的信号肽酶作用所致。
1．2 gp44/48，是病毒的一种囊膜糖蛋白．也称Erns．旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494组成。在感染细胞中gp44/48在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中gp44/48以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱．易从囊膜上游离下来。gp44/48可诱导产生猪瘟的中和抗体．免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码 gp44/48的核酸序列在属内比编码gp55的序列保守程度高，因此E rns可作为防治猪瘟的一种靶蛋白。
Erns具有RNase活性，作用于单链的 RNA．且对富含u的序列活性最高。4ng的 Ems在体外即可将CSFV基因组RNA完全降解。推测Ems没有将其自身RNA降解掉的原因可能是由于空间上的隔离。在宿主细胞中，新合成的E rns在内质网腔内．而其基因组RNA则在胞浆中：在病毒粒子中，定位于囊膜的Ems与其基因组RNA间隔着衣壳蛋白．因此E rns是不会降解其自身RNA的。编码Ems的基因是瘟病毒属病毒所特有的．黄病毒科中其他病毒基因组内无此基因．推测该基因是病毒与宿主细胞的RNase基因重组得到的。
1.3 gp33，是CSFV囊膜糖蛋白．也称E1，去糖基的蛋白骨架分子量21．8KDa．由1 95个氨基酸残基（ORF编码的Leu495至GlY68。组成，内有3个可能的糖基化位点。其蛋白骨架中有两段疏水序列（Leu548～ Pro579～Gly689）。在多聚蛋白转位过程中，前一段是E1向内质网腔转位的终止信号，后一段则充当E2转位的信号肽，除此之外，这二段疏水区还充当E1的膜锚定位点。E1在病毒囊膜内．不能诱导猪产生抗体。
1.4 gp55．为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为E2，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低．最易变异的分子。gp55常以100kDa的同源二聚体及与gp33形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。在体外gp55可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV的攻击的抗体。Hulst用20μg昆曳细胞表达的E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗1 00LD50 CSFV Brescia毒株强毒的攻击。gp55的蛋白骨架由370个氨基酸（ORF编码的690-1060氨基酸残基）组成．并以其c端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同。E2的分子量可为51-58kDa。E2分子内的1 5个Cys残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，c端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。
gp55的抗原决定区在其N端部分（ORF编码的第690-866氨基酸），可分为2个独立的抗原结构单元，四个抗原结构域A．B．C，D。其中结构域A又可分为A．， A2，A3三个亚域。结构域B．c属于一个结构单元．均为中和抗体的结合位点．由 ORF编码的690～800氨基酸残基参与构成。Cys693与CYS7377形成的二硫键对结构域 B、c的空间结构至关重要。另一个结构单元含A．D抗原结构域。A1、A2亚区定位于第795-851氨基酸残基，在种内保守A1是一个抗体的中和位点。亚区A3定位于766-813氨基酸残基．而氨基酸残基766-800则参与了结构域D的构成。cys792～ Cys856及Cys818～Cys828间的二硫键对这个结构单元空问结构的形成是必需的。连接这两个结构单元的是一段属内保守的疏水序列．推测这段序列参与了病毒侵入细胞过程中的膜融合过程。
1.5 Npro，也称p23，CSFV的非结构蛋白，是ORF编码的多聚蛋白N端的第一个蛋白质。Npro由168个氨基酸组成．具有蛋白质水解酶活性，能以自催化的方式从正在翻译的多聚蛋白上断裂下来，成为成熟的病毒蛋白。序列比较发现，编码p2 3的基因在瘟病毒属中是较为保守的。它的断裂位点在Cysl 68与其下游的病毒核衣壳p1 4 N端第一个氨基酸ser。间。Npro的 cys69和His130可能位于其酶活性中心．能水解断裂Cys与Ala及Gly与Ser间的肽键，断列位点位于活性His残基下游38个氨基酸残基处。Npro不参与CSFV的结构及非结构蛋白的加工过程．其蛋白酶活性在 c S F V增殖过程中的作用还不清楚。Rumenapf等人使用定点突变技术对参与 Npro催化活性的氨基酸残基进行测定．确定了其中的GIu22、His49和Cys69是保持Npro蛋白酶活性所必需的氨基酸残基，而 His130并非必须。
实验窒诊断
目前猪瘟流行常常表现无规律的地区性散发．发病特征不典型，以发热、精神沉郁、食欲减退、咳嗽、共济失调、结膜炎以及腹泻、围产期死亡、死胎、流产。中等毒力及强毒感染有以上这些症状，并且在猪群中不分年龄快速传播。结合这些临床症状进行实验室诊断是必要的。
2.1 病毒抗原的检测猪瘟病毒抗原的快速检测对于猪瘟的诊断具有特别重要的意义。目前快速、敏感的检测方法是利用免疫组化技术检测扁桃体组织。扁桃体中猪瘟病毒抗原可早在感染后2d检测到．淋巴结、脾脏以及胰腺均可作为病毒早期检测的组织样品。Delas Mulas等及Narita等报道了一种检测猪瘟病毒抗原的免疫组化方法．即利用针对E2糖蛋白的单克隆抗体检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品的免疫组化方法。该方法的优点是能检测长期保存的样品，缺点是较费时．而且福尔马林固定后的组织不能再进行病毒分离。利用链酶一生物素一过氧化物酶（ABc）的免疫组化方法也能用于猪瘟病毒组织切片上抗原的检测。据报道流式细胞仪也可进行血样中猪瘟病毒的检测，但其敏感性较低。以猪瘟强毒感染仔猪，利用抗原捕获ELISA方法检测其病毒血症，结果表明该方法可用于猪群中流行病学的调查。但其敏感性以及特异性均低于传统的实验室方法。
2.2 感染性病毒的检测病毒分离是目前体外检测感染性猪瘟病毒最特异的方法。已报道有几种方法可以从组织、全血中分离病毒，白细胞是分离病毒的最佳样品。然而一些研究人员发现，白细胞以及单核细胞在动物感染后较长时间才能感染病毒。因此，对于猪瘟的早期诊断．全血或血浆可能比白细胞更为敏感。最常用于猪瘟病毒分离的细胞为猪肾细胞（PKl 5或SK6）或猪睾丸细胞（sT）。日本建立了一种猪肾由来的传代细胞系（FS-L3）．FS-L3细胞在不感染病毒的情况下呈大园球状．数倍至数十倍于普通细胞．但一旦感染了猪瘟病毒，FS-L3细胞的大园球状即消失．这一特性已被用作猪瘟病毒的中和试验等各种生物学特性的测定。经研究发现，产生细胞病变的毒株是因为它的遗传基因发生了变化。从5’末端的第一个核苷酸到4764个核苷酸均已缺失．其中包括5’末端的非编码区、自身蛋白分解酶、衣壳蛋白、糖蛋白（E0、 E1、E2）、非结构蛋白NS-1、和NS-2的基因均已缺失。
2.3 猪瘟病毒基因组检测 已报道利用RT-PCR方法检测猪瘟病毒RNA有数种程序。瘟病毒属特异的引物多选自基因组的5’端保守区．其最突出的优点是其产物能用来直接测序，直接进行病毒株的分型。一般来说套式RT-PCR方法是检测猪瘟病毒更敏感的方法，但其缺点是比较费时．不适用于大量样品的检测。McGoldrick等报道了一种检测猪瘟病毒的单管荧光RT-PCR方法。此方法可检测出仔猪血样中感染了中等毒力或高等毒力的猪瘟病毒，其敏感性高于病毒分离方法．并且简化了试验程序．减少了污染的风险．还可进行大量样品的检测。
2.4 抗体检测最常用的检测猪瘟病毒抗体的方法多以病毒中和试验为基础。目前已建立数个特异的检测血清抗体的E LlSA方法．包括检测针对粗蛋白、特异结构蛋白如E2、E rns以及非结构蛋白NS3抗体的方法。目前使用最广泛的是CSFV E2 ELISA，其敏感性与VNT相比为90%～99%．特异性为99%。Leforban等建立了一种ELISA方法，能够区分BVDV、BDV以及 CSFV抗体。这个方法对于BVDV/BDV高流行地区（如荷兰)csF的检测非常有意义。ELISA特异性与敏感性的提高是目前面临的最大的挑战。
当前，猪瘟仍是世界养猪业的一大威胁．1 997-1 999年期间在德国、荷兰、西班牙和意大利等国都曾多次暴发了猪瘟，在中国CSFV的持续性感染和疫苗保护效力下降的现象也比较普遍，这不仅给养猪业造成了严重的经济损失，而且也给猪瘟防治政策的制定带来了一定的困难。不过，相信随着CSFV分子生物学和检测方法研究的进一步深入，这些问题都会得到最终解决。

2. 猪得了猪瘟咋办呢

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。急性病例呈败血症变化；慢性病例主要在大肠，特别是在回盲口附近发生纽扣状溃疡。因此，该病又叫“烂肠瘟”。不分年龄、性别、体重大小，也不分季节，一旦猪群中一头发病，会很快在全群中流行，死亡率较高。病的潜伏期平均为7天。
病猪主要表现体温升高到41℃以上，持续不退，精神沉郁，食欲减退或不食，眼发红，有眼眵，弓背，打冷战，走路打晃，常喜钻草堆。病初粪便干燥，后期拉稀。公猪包皮积尿，皮肤出现大小不一的紫色或红色出血点，指压不褪色。严重时出血点遍及全身，常有咳嗽。有的出现神经症状，打转转，或突然倒地、痉挛，甚至死亡。
剖检皮肤有点状出血，喉头、肾脏、膀胱均有针尖状与小米粒般大出血点（指压不褪色），脾脏有出血性梗死，回盲瓣有纽扣状溃疡。
【防治措施】
目前，对于该病还没有有效的治疗方法，主要靠平时的预防。
（1） 定期预防注射，每年春秋两季，除对成年猪普遍进行一次猪瘟兔化弱毒疫苗注射外，对断奶仔猪及新购进的猪都要及时防疫注射。将猪瘟兔化弱毒疫苗按瓶签说明加生理盐水稀释，大小猪一律肌内注射1毫升，注射后4天即可产生免疫力。
（2） 猪瘟常发疫区，仔猪出生后21～30日龄注射一次，55～60日龄仔猪断奶后再注射一次，保护率可达100%。
（3） 紧急免疫接种，在已发生疫情的猪群中，做紧急预防注射，能起到控制疫情和防止疫情扩大蔓延的作用，注射时可先从周围无病区和无病猪舍的猪开始，后注射同群猪，病猪一般不注射。为加强免疫力，注射时可适当增加剂量。
（4） 加强饲养管理，定期进行猪圈消毒，提高猪群整体抗病力，杜绝从疫区购猪。新购入的猪应隔离观察30天，证实无病，并注射猪瘟疫苗后方可混群。
（5） 在猪瘟流行期间，饲养用具每隔3～5天消毒一次。病猪消毒后，彻底消除粪便、污物，铲除表土，垫上新土，猪粪应堆积发酵。在病猪初期，可试用抗猪瘟血清给猪注射，其剂量为每千克体重2～3毫升，每天注射一次，直至体温恢复正常。

3. 请问如何检测猪瘟病毒

猪瘟又称“烂肠瘟”，是由黄病毒科瘟毒病属的猪瘟病毒引起猪的一种急性、发热、接触性传染病。急性病例呈败血症的临诊症状，剖检可见内脏器官出血、坏死和梗死。慢性经过的病例，主要是纤维素性坏死性肠炎。常有副伤寒及巴氏杆菌病继发感染。由于贯彻了预防为主的方针，猪瘟基本上得到了控制。但猪瘟仍是目前危害较大的疫病，在不断总结防治经验的基础上，应该继续做好防疫工作，减少猪瘟造成的损失。
诊断要点
发病特点
在自然情况下，只是猪和野猪感染发病，任何年龄、品种、性别的猪都可以发病；本病在任何季节都可以发生。
不按期进行预防注射的地区，一旦发病，在短期内可造成广泛的流行。发病和死亡都很高。在常发地区或注射密度不很高的地区，可呈零星散发。
病猪是主要的传染源。传染途径主要是消化道，也可通过呼吸道、眼结膜及皮肤伤口感染。猪只的买卖、运输、尸体处理不当，肉品卫生检验不严，兽医卫生措施执行不力，人、动物和昆虫等都可成为间接的传染媒介，促进本病的发生和流行。通过胎盘传染使子猪患病，成为防治中十分棘手的问题。
临诊症状
猪瘟与发生败血症的猪丹毒、猪肺疫和子猪副伤寒在症状方面很相似，较难分辨，应注意区别诊断。猪瘟的临诊特点是：体温升高到40.5℃～41℃，呈稽留热，有脓性结膜炎，病初便秘，后腹泻；在病猪耳后、腹部、四肢内侧等毛稀皮薄等处，出现大小不等的红点或红斑，指压不退色；公猪有包皮发炎，用手挤压时，有恶臭混浊液体射出，急性病例，多在1周左右死亡，死亡率可达60%～80%；小猪有神经症状，慢性病例，体温时高时低，食欲时好时坏，便秘与腹泻交替发生，病猪明显消瘦，毛焦臁糜，行走不稳。一般病程可达20天或以上，死亡居多。
病理剖检变化
急性猪瘟主要呈败血症变化，有诊断价值的变化是：皮肤或皮下有出血点；颚凹、颈部、鼠蹊、内脏淋巴结肿大，呈暗红色，切面周边出血；肾脏色淡，不肿大，有数量不等的小点出血；脾脏边缘梗死；喉头黏膜、会厌软骨、膀胱黏膜、心外膜、肺及肠浆膜黏膜有出血。慢性病猪特征的变化是盲肠、结肠及回盲口处黏膜上形成扣状溃疡。
实验室检查
常采用的方法有：血清学检查、猪瘟兔化弱毒免体交互免疫试验，生物学试验（非免疫猪种）、荧光抗体试验等。
近些年来，急性猪瘟少发，常有非典型性猪瘟（温和型）病猪出现，其特点是病型温和，病热缓慢，病变局限，呈散发等不典型表现，这就须经实验室检验方可做出可靠的诊断和鉴别。
防治方法
做好平时的预防工作
做好猪瘟的预防注射工作，是防止猪瘟发生的关键措施。每年采取定期注射和适时补针相结合的办法，用猪瘟兔化弱毒冻干苗，稀释后大小猪一律肌肉注射1毫升。注射后第4天即可产生免疫力，免疫期可达1年以上。选择适合本场的免疫程序。
实行自繁自养的办法
若需要从外地购买猪种，运回后还须隔离饲养半个月左右，并进行疫苗注射，进行实验室猪瘟抗原检测阴性，方可混群饲养。
加强集市管理和运输检疫
杜绝病猪在集市出售和收购、运输，以防传播疫病。生猪交易市场、猪库、屠宰场等猪只集中场所，特别应加强兽医卫生管理及检疫措施。
改善饲管
改善饲养管理，搞好圈舍、环境及管理用具的兽医卫生、消毒工作。
发生猪瘟时的紧急措施
目前尚无有效药物治疗猪瘟。早期诊断，及时采取措施，对控制和消灭猪瘟，减少经济损失有重要意义。
（1）病猪及可疑病猪，立即隔离饲养。特别是贵重的种猪，在备有抗猪瘟血清的单位，可用于治疗。
（2）对发病猪场及附近尚没有发病的猪只，立即全部用猪瘟兔化弱毒疫苗进行紧急注射，可有效地制止新的病猪出现，缩短流行过程，减少部分损失。
（3）发病猪舍、运动场、饲养管理用具，用2％热碱水或30％草木灰水等进行消毒。粪尿及垫草等污物，堆积发酵后作肥料利用。
（4）死猪深埋或销毁、化制；急宰病猪的肉，可根据当地条件，同有关人员商定处理办法。

4. 哪里能检测非洲猪瘟病毒，检测要多长时间

农业农村部：在动物检疫中对生猪及其产品开展非洲猪瘟病毒检测，应当使用我部批准或经中国动物疫病预防控制中心比对符合要求的检测方法及检测试剂盒（试纸条），确保检测结果准确。符合要求的检测方法及检测试剂盒（试纸条）可从中国动物疫病预防控制中心网站查询。

中国动物疫病预防控制中心与中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位共同组成了评价专家组，开展了非洲猪瘟现场快速检测试剂评价工作

中国动物疫病预防控制中心：

非洲猪瘟病猪主要临床表现差异较大，不易识别，但通常有以下几种或全部典型症状，包括高热、呕吐、腹泻或便秘，有的便血，虚弱、难以站立，体表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮肤呈红色、紫色或蓝色，有的咳嗽、呼吸困难，母猪流产、产死胎或弱胎。出现上述临床症状后，一般2-10天内死亡。剖检可见内脏多个器官组织出血，脾脏显着肿大，颜色变暗，质地变脆。部分首次发生非洲猪瘟的养殖场，猪群发病非常急，最急性型不表现任何症状而突然死亡，无特征性剖检病变。

资料来源：中国动物疫病预防控制中心《非洲猪瘟现场排查手册》

5. 猪病常用的血清学诊断方法有哪些

抗原和相应的抗体在动物体内或体外都能发生特异性结合反应，这种反应称为抗原抗体反应，习惯上把体内的抗原抗体反应称为免疫反应，体外的抗原抗体反应称为血清学反应，因为抗体主要存在于血清中。

血清学反应可以用已知的抗体检查未知的抗原，也可用已知抗原测定未知的抗体。人们根据抗体能与相应抗原发生反应并出现可见的抗原—抗体复合物的原理，设计了许多血清学诊断方法，不仅可以检测动物体内乃至体外的病原微生物，或其抗原性成分，而且还可以测定动物机体对病原微生物的侵袭或对其抗原成分的免疫反应。在抗原—抗体复合物成不可见状态时，可以通过琼脂扩散、凝集实验以及酶标记等指示系统，使其变为可见或可测状态。

目前已知的血清学诊断方法很多，现仅介绍几种在目前条件下规模化猪场通过学习都能做到的诊断方法：

（1）凝集试验猪病诊断过程中常用的操作方法有以下几种：

①全血平板凝集试验实践中主要用于细菌性疾病的抗体检测和抗原（经分离培养后）的鉴定。现举例用已知猪丹毒抗原（丹毒杆菌的纯培养液）测定被检猪血清中的抗体。其操作步骤如下：

a.材料猪丹毒凝集抗原，玻片，9号针头，酒精棉球，酒精灯，铂耳（取血环）等。b.操作用铂耳取已知抗原1滴，置于玻片上。用酒精棉球擦拭针头，铂耳在酒精灯上灼烧消毒。用针头刺破被检猪的耳静脉，以铂耳取血与玻片上的抗原等量混合，在2～3分钟内观察结果。c.结果判定出现颗粒状的凝集，为阳性反应。否则为阴性。

②试管凝集试验是一种定量法，用于测定被检血清或其他体液中有否某种抗体及其效价，可做临床的辅助诊断，或用于流行病学监测。在猪场中，本法常用于猪布氏杆菌病的诊断。

A.材料布氏杆菌病试管凝集抗原（1∶20倍稀释），布氏杆菌病阳性血清、阴性血清（1∶25倍稀释），稀释液（0.5 %石炭酸生理盐水），灭菌小试管，1毫升吸管，试管架，待检血清等。B.操作取试管7支置于试管架上，设阳性和阴性血清及抗原对照各1支，测定管4支，以后每增加1个样品，只需增加4支测定管。

按表10示意稀释血清，加抗原，完成后每支试管内应含1毫升液体。