㈠ 乳酸、丙酮酸和乙酸如何鉴定
丙酮酸检测试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织以及培养细胞、细胞培养上清液等样本中丙酮酸含量。丙酮酸与显色剂反应，反应产物在碱性溶液中显红棕色，颜色深浅与丙酮酸含量成正比，通过比色可以测定出丙酮酸的含量。
原理：丙酮酸盐检测试剂盒提供了一种简单、直接和可自动化操作的程序来测量不同生物学标本中丙酮酸的含量。适用标本类型包括：食物、细胞、培养基和发酵培养基。丙酮酸盐检测试剂盒基本原理如下：丙酮酸盐被丙酮酸酶氧化，在酶反应过程中产生颜色（λ=570 nm）或者荧光（Ex/Em=535/587 nm），可使用酶标仪或荧光计检测到。光的强度与丙酮酸含量是成正比的，因此通过检测光的强度即可精确的得到丙酮酸的含量。试剂盒检测范围为1-10 uM丙酮酸。
丙酮酸检测试剂盒
丙酮酸分子式CH3COCOOH，原称焦性葡萄酸(德Brenztr-aubensure)，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一。丙酮酸可通过乙酰CoA和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。
丙酮酸是糖无氧代谢的产物，研究工作者将丙酮酸和乳酸一同测定，并用二者的比值推测循环衰竭的严重程度；此外，它还对维生素B1缺乏有一定的研究意义，同时作为一种重要的精细化工中间体,广泛应用于医药、农药、食品等领域,尤其是作为医药中间体,具有良好的发展前景。
应用[4][5]
用于大肠杆菌丙酮酸代谢途径改造及丙酮酸高产菌株培育
丙酮酸作为最重要有机酸之一,在医药、食品、化工等领域以及科学研究中都具有广泛的用途。目前高质量的丙酮酸在国内市场缺口较大,丙酮酸工业化生产的前景十分广阔。
从野生型大肠杆菌K-12 MG1655菌株出发,利用CRISPR/Cas9技术敲除了乳酸脱氢酶基因（ldh A）,截断了乳酸合成途径;敲除了丙酮酸氧化酶基因（pox B）、磷酸转乙酰基酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ack A）,截断了乙酸合成途径;敲除了丙酮酸-甲酸裂解酶基因（pfl B）,截断了甲酸合成途径;敲除了磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因（pps A）,减少了丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸;敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ppc）,减少了磷酸烯醇式丙酮酸的消耗;通过敲除延胡索酸还原酶复合体基因（frd BC）,削弱了三羧酸循环途径。最后得到了一株可以初步积累丙酮酸的基因工程改造菌株MG1655-GP7（E.coli K-12 MG1655Δldh AΔpfl BΔack AΔptaΔpox BΔppcΔfrd BCΔpps A）,这株菌在使用5 L发酵罐发酵68小时后丙酮酸产量达到32.07 g/L。
这表明只利用基因工程的手段是可以使大肠杆菌积累丙酮酸的。大肠杆菌利用葡萄糖作为碳源时,葡萄糖经糖酵解途径会产生过量的ATP与NADH从而抑制丙酮酸的积累,使用氧化程度较高的葡萄糖酸作为碳源可解决此问题;当葡萄糖进入细胞后不经EMP途径而是进入Entner-Doudoroff（ED）途径,产生的ATP与NADH的量只有前者的一半,会相应的促进丙酮酸的积累。为了进一步提高产量,作者又敲除磷酸葡萄糖异构酶基因（pgi）以抑制糖酵解途径;同时敲除6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（gnd）以抑制磷酸戊糖途径,并减少6-磷酸-葡萄糖酸的消耗;还在敲除磷酸葡萄糖转移酶基因（pts G）和磷酸烯醇丙酮酸葡萄糖转移酶基因（pts I）的基础上敲入运动发酵单胞菌中葡萄糖转运蛋白基因（glf）来改良葡萄糖转运系统,减少大肠杆菌细胞转运葡萄糖时磷酸烯醇式丙酮酸的消耗。
并计划上调葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（zwf）、葡萄糖酸-6-磷酸脱水酶基因（edd）和2-酮-3-脱氧葡萄糖酸-6-磷酸醛缩酶基因（eda）的表达以强化ED途径,平衡ATP和NADH的水平,引导碳流更多的流向丙酮酸合成方向。
目前通过基因编辑的方法得到了一株生产丙酮酸能力理论上较MG1655-GP7菌株有所提高的MG1655-GP12（E.coli K-12 MG1655Δldh AΔpfl BΔack AΔptaΔpox BΔppcΔfrd BCΔpps AΔgndΔpgiΔpts GΔpts I::glf）菌株,该菌株的生产能力正在评估中。但经多次基因改造后,基因工程菌株MG1655-GP12出现了较野生型菌株生长缓慢的现象,本实验对该菌株进行了实验室适应性进化,经多次传代后筛选到一株生长速度恢复到野生型菌株75%的MG1655-GP12-1菌株。
㈡ 阿司匹林含量的测定方法及适用对象
一，分光光度法测定阿司匹林肠溶片的含量
目的: 建立分光光度法阿司匹林含量的测定方法。方法: 在碱性条件下, 乙酰水杨酸与羟胺反应生成羟肟酸; 在酸性溶液中, 后者与三氯化铁形成红色的羟肟酸铁, 一定浓度范围内, 吸光度呈线性关系。结果: 在520nm 波长下, 采用标准曲线法, 测得阿司匹林肠溶片中乙酰水杨酸的含量为25mg/ 片。结论: 方法操作简便、快速、准确; 可用于阿司匹林含量的测定和产品质量控制。
阿司匹林( C9H8O4, 180.16) 又名: 2-(乙酰氧基) 苯甲酸,或乙酰水杨酸, 是常用的解热镇痛药, 临床上多用于治疗心脑血管方面的疾病, 也可用于消化道肿瘤和老年性痴呆症的预防。
阿司匹林药片中乙酰水杨酸的含量测定, 大多采用酸碱滴定法测定和高效液相色谱法分析测定。本方法采用可见分光光度法测定阿司匹药片中乙酰水杨酸的含量, 操作简便、快速、准确, 实验成本低, 可用于阿司匹林药品的分析和产品质量控制。
1.仪器和材料
仪器: 722 型分光光度计( 上海) , 容量瓶( 25mL) , 吸量管( 5mL , 1mL) 。材料: 2mo l/L NaOH , 4mol/L H Cl, 10%FeCl3 , 7%盐酸羟胺乙醇液; 0. 5 g / L乙酰水杨酸标准溶液; 阿司匹林样品溶液( 阿司匹林肠溶片, 配制成20 片/L 乙醇液) 。
2方法和结果
阿司匹林肠溶片的主要成分为乙酰水杨酸,分子中酯基在碱性溶液中可与羟胺反应生成羟肟酸;后者在酸性条件下与三氯化铁形成酒红色的羟肟酸铁,最大吸收波长为520nm,在一定浓度范围内,吸光度呈线性关系,可测出阿司匹林药片中乙酰水杨酸的含量。
2•1标准溶液系列和样品溶液的配制
分别取0.5g•L-1乙酰水杨酸标准溶液0.00mL(空白溶液),0.50mL,1.00mL,1.50mL,2.00mL和阿司匹林样品溶液1.00mL置于25mL容量瓶中,分别加入7%盐酸羟胺乙醇液1.00mL,2 mol•L-1NaOH 1.00mL,放置3分钟,再分别加入4 mol•L-1HCl和10%FeCl3各1.00mL,加水至刻度,摇匀。
2•2标准曲线的绘制
标准溶液系列和样品溶液放置10分钟后,用空白溶液做对照,在520nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标作图,绘制出标准曲线表1。
二，阿司匹林制剂的电极法测定
摘要以三苄基锡辛酸酯为活性物质, 制备具有良好的电位响应性能和选择性能的PVC 膜水杨酸根离子敏感电极。该电极应用于阿司匹林制剂的含量测定, 方法快速、方便、准确。标准曲线与样品加入两种电极测定法回收率分别为101. 1%和101. 3%。
1仪器与试剂
电极电位和溶液酸度测试均使用pHs-10C 型数字式酸度离子计( 浙江萧山市科学仪器厂) ; 参比电极为232 型饱和甘汞电极( 上海光电器件厂) ; 邻硝基苯基辛醚系本实验室自制, 其余试剂均为分析纯, 实验用水为去离子水经高锰酸钾处理后蒸馏而得。
2电极制备与性能测试
将载体物质三苄基锡辛酸酯( 按文献方法合成) 20 mg 、聚氯乙烯( PVC) 0. 33 g 和增塑剂邻硝基苯基辛醚0. 65 g 溶解于四氢呋喃( THF) 3 g 中, 搅拌澄清后将其倾倒于40 mm×40 mm 的水平玻璃板上。待THF挥发完后( 约需12 h) 即得到具有弹性的PVC 膜。用打孔器切下直径10 mm 的圆片并用含5%PVC 的THF 溶液粘于PVC 电极杆端, 放置数小时, 晾干后电极杆内充以0. 1mo l/ L 的水杨酸钠( NaSal) 溶液作为内参比溶液并以Ag/ AgCl 丝作为内参比电极导出至离子计。电极使用前需于10- 3 mol/ LNaSal 溶液中浸泡2 h 进行活化处理。电极及备用膜长期不使用时可洗净后, 置于氮气氛围下保存。在此条件保存, 电极的各项性能指标至少可于5 个月内维持稳定。在pH5. 5 的磷酸盐缓冲溶液中测试了电极的电位响应性能。结果表明, 该电极对于10-1～5×10-6 mo l/ L 浓度范围内的水杨酸根离子具有线性响应, 斜率值为- 57.6 mV,表现出良好的稳定性与重视性。电极具有较快的电位响应: 对于各种浓度的待测样品, 其稳态响应时间( t95%) 均小于30 s, 可以实现水杨酸根离子的快速测定。采用等活度分别溶液法测试了了电极的选择性能, 得到其相对于NO3- 、Cl-、AcO-和SO2-4 的选择性系数值分别为7.5×10-5、2.1×10-5、9. 0×10-4和< 10-5。该电极表现出对水杨酸根离子的高选择性。
3阿司匹林制剂的分析
3. 1待测样品的处理
阿司匹林易水解得到水杨酸根离子, 且反应定量。因此, 通过对水杨酸根离子的测定即可得出样品中的阿司匹林含量。阿司匹林片( A) 和复方阿司匹林片( B) 均处理如下: 将适量药品( 10 片) 研制成粉状, 精密称取1～1. 5 g , 在0. 5 mol/ L NaOH 溶液25 ml 中加热回流1 h 后过滤, 定容至250 ml。吸取10ml 滤液, 用稀硫酸调至pH 5. 5, 再用pH 5. 5的磷酸盐缓冲液定容至100 ml 作为待测液。
3. 2测定结果
使用该电极通过标准溶液法和样品加入法, 分别测定药品A 和B 经前述处理后所得试样中的水杨酸根离子浓度, 通过换算得出药剂中阿司匹林的含量, 所得结果见表1。表1 中的参照值系对样品采用药典推荐方法进行测定得到的结果( 3 次测定平均值) 。
三 酸碱滴定法
（1）直接滴定法
原理；阿司匹林与氢氧化钠反应生成乙酰水杨酸钠和水
pKa3～6都有游离羧基，显酸性。
• 方法：取本品0。4g，精密称定，加中性乙醇20ml，溶解，加酚酞指示液3d，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）滴定。每1ml滴定液相当于18.02mg 的C9H8O4。
• 优点：简便、快速。
• 缺点：酯键水解干扰（不断搅拌、快速滴定）。
• 酸性杂质干扰（如水杨酸 ）。
• 适用范围：不能用于含水杨酸过高或制剂分析，只能用于合格原料药的含量测定。
中性乙醇：取乙醇加入2滴酚酞指示液，用稀氢氧化钠溶液滴至溶液刚好呈粉红色，即可。PH值为8左右
（2）水解后剩余滴定
• 原理；利用阿司匹林酯结构在碱性溶液中易于水解的特性，加入过量的氢氧化钠滴定液。加热使酯键水解，剩余的氢氧化钠滴定液用硫酸滴定液回定
• 方法：取本品1.5g，精密称定加氢氧化钠滴（0.5mol/l） 50.0ml，混合，缓缓煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/l）滴定剩余的氢氧化钠。
• 由反应式得知，硫酸标准液与阿司匹林的摩尔比为1∶1
•
• 优点：消除了酯键水解的干扰
• 缺点：酸性杂质干扰
四，高效液相色谱法
• 【仪器与试药】仪器：高效液相色谱仪；CLASS—LC工作站。色谱柱：ODS C18色谱柱(150mm x 4．6mm，填料：Kromasil，粒度：5um)。
• 试药: 阿司匹林对照品，甲醇(色谱纯试剂)，冰醋酸、盐酸(分析纯试剂)。
【方法】取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于阿司匹林10mg)，置100m1量瓶中，加0．1mol/l盐酸溶液适量，超声使阿司匹林溶解，放冷至室温，加0．1mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5m1，置25m1量瓶中，加0．1mol/l盐酸溶液稀释至刻度，格匀，取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。另取阿司匹林对照品适量，加0．1mol/l盐酸溶液溶解并稀释制成每l m1中约含阿司林20ul的溶液，取20ul同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。