非反应性研究方法

1. 临床生物化学的研究方法

临床生物化学在方法建立的原理确定后，尚需根据其原理来选择合适的条件，以保证所建的方法可靠。下面以光度法为例介绍其条件选择的主要环节。颜色反应是光度分析的基础，因此，用作光度测定的颜色反应至少要具备以下几条：反应有较高的特异性，从而干扰小；反应产生的有色物质吸光系数要大，大者灵敏度高；有色产物的离解度要小，小则稳定；此外，还要求有色产物有恒定的组成成分，使产生的颜色稳定。由于影响颜色反应的因素很多，如温度、pH、试剂浓度、反应的时间等等。这些因素在建立新方法时都要逐项试验，确定最佳实验条件。
选择合适的吸收光谱
实际上就是测定颜色反应产生的光吸收曲线。方法是在整个可见光区（400-700nm）以10nm（在接近最大吸收波长范围还应再细分）间隔。分为十几个点测定其在不同波长时的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标绘成光吸收曲线。在条件许可的情况下，应采用双光束分光光度计在可见光区进行波长扫描，结果较为可靠。同时，还应以同法分别测定其空白液和标准物颜色产物的吸收曲线。测定光吸收曲线的目的是找出最大吸收波长，作为光度法波长选择的依据。因为在最大吸收波长测定，可获得最大灵敏度，且能更符合比耳定律。然而在实际使用中，不能单纯考虑灵敏度高，还要考虑在测定浓度范围能否符合比耳定律，并能在光度计准确区域内（吸光度0.2-0.85之间）读出读数。有时由于测定的最大吸收波长并不是所要测定物质的特性吸收波长，即同时存在具有相似最大吸收的干扰物质，为了保证实验的特异性，常改用特有而非最大吸收波长进行测定。例如用磷钼酸测定血糖，选用波长420nm，溶液对此波长的吸收比其它波长光线的吸收都低，其目的是使参考值有一个较低的吸收，这样可允许在相同情况下对高出参考值的血糖也能得到准确的读数。因为在这项测定中，高血糖是常见的变化方向。
测定方法适用的浓度范围
根据光吸收定律，溶液的吸光度应与溶液的浓度成正比。但由于有色物质的电离、水解、缔合等原因当溶液稀释或增浓时，有色物质颜色的深浅并不按比例降低或增高，因而也就不符合光吸收定律。测定方法适用的浓度范围是指分析的浓度范围在直线线性段，浓度与吸光度之比为一常数，此时直线上任何一点的斜率tanθ相等，即：
tanθ=A1/C1=A2/C2=A3/C3=……=An/Cn=K
此处K即为校正常数，可用于结果计算。
通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在浓度过高和过低时往往都不呈直线，说明低浓度部分亦有仪器的灵敏度和方法的检测能力限制，所以，具体的测定就宜选择在直线段浓度范围内进行。以此还可用于确定标本的用量，使具有临床意义的标本测定结果都落在直线范围内。
观察影响颜色反应的因素
影响颜色反应的主要因素有：溶液pH的影响、杂质的影响、反应的温度和时间、以及颜色的稳定性等。这些都是光度法测定误差的主要来源。都需要通过实验来观察并控制在一个适宜的范围内。从而保证方法的准确性和精密性。
溶液pH的影响有些溶液的颜色对pH值的改变非常灵敏。例如白蛋白在pH4左右可与溴甲酚绿结合后由黄色变成绿色，绿色的深浅与白蛋白浓度成正比，但是溴甲酚绿本身是一种pH指示剂，当pH5.4时即由黄色转变成绿色，在pH3.8时又由绿色变为黄色。在白蛋白与溴甲酚绿结合颜色反应中，如pH控制不好就很容易出现误差，又如每种酶都有各自的最适pH，酶促反应中，只有在其最适pH时才能发挥充分的催化活性。因此，在建立方法时可在不同pH值条件下（其它条件不变）令其反应，以观察颜色反应的吸光度变化，从而选择合适的pH值范围来保证颜色反应，以求较高的灵敏度和较好的线性。有时还需用相应的pH缓冲液来维持反应的pH，以利颜色反应的正常进行。
杂质的影响由于临床生化标本中除含待测物质外，还含有许多非测定物质，成分十分复杂，它们有的可与有色产物作用，使产生的颜色逐渐退去，有的与待测物质相类似，也能缓慢地与显色试剂生成有色化合物或沉淀，有的本身是有色的等，都会影响被测物溶液的颜色。试验方法是将各种可疑物质的纯溶液作标本单独进行测定，如产生颜色反应，这说明该方法的特异性不高。如果将待测物质混入可疑物质作标本测定，改变了被测物质与试剂间的反应，这是干扰。为此就需要进一步改进方法，或设立标本空白，或将标本作适当处理，除去干扰物，或加入合适的干扰物掩蔽剂等，以提高方法的特异性。
反应的温度和时间有些有色物质能迅速反应生成，另一些有色物质须经过相当长时间后反应才能完全。提高反应的温度可以加速化学反应，缩短反应的时间。因此，如果在不恰当的温度和时间内进行比色，将会造成相当大的误差。这可以在不同的温度下（如设定25℃，30℃，37℃）令其反应，通过检测吸光度来观察各自反应终点时间（一般达到反应终点，随后测定的吸光度不再变化），以选定适宜临床应用的反应最佳温度和时间。
稳定性试验待测物质经显色反应产生的有色物稳定与否，关系到测定结果的可靠性。某些有色物质虽然生成很快，但却不太稳定，放置后色泽会逐步消退或起变化，有些干扰物虽不能与被测物质同时发生颜色反应，但当放置一段时间后也能缓慢地与试剂显色，使溶液颜色加深。因此，在方法建立的同时作稳定性试验很有必要。试验的方法是用被测标本、标准溶液、空白溶液按方法要求进行显色反应后，即刻及室温放置不同时间，分别测定其吸光度，根据其吸光度的变化确定方法稳定的时间范围。一般要求有色溶液能稳定二小时以上就能满足临床应用的需要。必要时还要加以注明。

2. 文献研究方法有哪几种

文献研究方法有三种，分别是内容分析法、文献计量法、文献研究法。其中内容分析法指的是一种系统、客观、能对明确的传播内容进行定量描述的研究方法。文献计量法指的是借助文献各种特征的数量，采用数学与统计学方法来描述、评价和预测科学技术的现状与发展趋势的定量分析方法。文献研究法指的是搜集、整理、鉴别文献，并通过对文献的研究形成对事实的科学认识的方法。

文献研究法主要优点：

1、文献法超越了时间、空间限制，通过对古今中外文献进行调查可以研究极其广泛的社会情况。这一优点是其他调查方法不可能具有的。

2、文献法主要是书面调查，如果搜集的文献是真实的，那么它就能够获得比口头调查更准确、更可靠的信息。避免了口头调查可能出现的种种记录误差。

3、文献法是一种间接的、非介入性调查。它只对各种文献进行调查和研究，而不与被调查者接触，不介入被调查者的任何反应。这就避免了直接调查中经常发生的调查者与被调查者互动过程中可能产生的种种反应性误差。

4、文献法是一种非常方便、自由、安全的调查方法。文献调查受外界制约较少，只要找到了必要文献就可以随时随地进行研究；即使出现了错误，还可通过再次研究进行弥补。

5、文献法省时、省钱、效率高。文献调查是在前人和他人劳动成果基础上进行的调查，是获取知识的捷径。它不需要大量研究人员，不需要特殊设备，可以用比较少的人力、经费和时间，获得比其他调查方法更多的信息。因而，它是一种高效率的调查方法。