激酶研究方法

‘壹’ 1.激酶在生物体内主要催化哪些生化反应

生物体内的各种化学反应大都是在酶催化下进行的，故称其为酶促反应。酶是由活细胞生成的生物催化剂，其本质主要是蛋白质，通常按酶的组成将其分为单纯酶和结合酶；根据蛋白酶分子的特点分为单体酶，寡聚酶和多酶复合体；国际酶学委员会(E C)根据酶促反应类型将酶分为六大类；氧化还原玻、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和成酶。
在对酶的研究中，我们发现有为数不少的酶在其名称后面均有 激酶"二字，如肠激酶、尿激酶、链激酶等等。按一述有酶的分类法，激酶是属于哪一类酶呢 除了蛋白激酶，己糖激酶等在生物化学教科书中已明确说明是属于转移酶类外，其它激酶尚无明确分类。在酶的系统命名法的原则中，强调标明酶的底物及催化反应的性质，因此，必须将激酶按其催化反应的性质，将激酶进行分类，才能对激酶的系统命名法，因为在系统命名法中，对每种酶都用四个阿拉伯数字编写，其中一个数字是该酶按酶促反应类型所分的类型，如氧化还原酶类的编号，第一个数字为1，转移酶类的编号第一个数字为2，依次类推。
我们将激酶按其对底物作用不同，分为3种，即激活酶原的激酶、改变酶的活性的激酶，直接参与酶促反应的激酶，对3种作用机制分别进行了探讨，同时根据激酶的作用机制不同，确定其反应类型，从而将常见的激酶分别归入国际酶学委员会(E C根据酶反应所分的酶的六大类型之中。
1激活酶原的激酶
酶原是指没有催化活性的酶的前体，酶原激活的本质是促进酶的活性中心形成或暴露的过程，因此，激酶对酶原的激活就是促进酶的活性中心的形或暴露。有些激酶在对酶原的激活时，通过水解作用，切除酶原的部分肽链，使剩下的肽链重新折叠，形成活性中心。如肠激酶在对胰蛋白酶原的激活对....:

‘贰’ PTK激酶的相关研究

受体型酪氨酸蛋白激酶所介导的信号传递途径中涉及到一种重要的蛋白激酶即丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）。MAPK属于一种Ser/Thr蛋白激酶，可在多种不同的信号转导途径中充当一种共同的信号转导成份，且在细胞周期调控中发挥重要的作用。目前MAPK家族中至少有4个成员已被纯化和深入研究。如p42mapk,p44erk1,p54MAPK及p44mpk。这些MAPK最初由于不同的研究目的而被发现，因而它们各自还有着其它一些名称。如p42mapk也称为微管相关蛋白激酶（microtubule-associated protein-2 kinase,MAP-2k）及细胞外信号调节的激酶2（extracellular signal-regulated kinase2,ERK2）等。
属于src家族的蛋白酪氨酸激酶是一组膜结合蛋白，包括p60arc、p56lck、p59fyn、p59yes、(p62ues)、p56lyn、p59hck、p55fgr和p55blk等成员。但由于src家族PTKs缺乏胞外及跨膜序列，因此这些src家族PTKs通过其N末端与细胞膜表面蛋白的胞浆内结构域相连接，从而发挥信号转导作用（表8-2）。已证实p56lck参加CD4和CD8介导的信号传递；p59fyn参加TCR/CD3复合体介导的信号传递；p56lyn参加B细胞受体（BCR）介导的信号传递。
经TCR途径T细胞活化后最早生化事件是几种内源性底物酪氨酸磷酸化水平的升高。这种酪氨酸磷酸化可能由p56kk或一个与PTK相关的称为p59fyn所介导。p59fyn主要表达于T淋巴中，发挥某些独特的调节功能。然而，还有一些调节功能更为广泛的PTKs表达于包括T细胞在内的多种细胞类型中，包括：
（1）最初从小鼠脾细胞中发现的tk1蛋白产物；
（2）在T细胞有丝分裂中数量可见增加并同T细胞瘤的发生有关的p34pim；
（3）表达于T细胞中c-abl、ltk、c-kit和其它原癌基因蛋白产物。这些PTKs的确切功能还不清楚。
2.Tyrosine kinases are a subclass of protein kinase, see there for the principles of protein phosphorylation
3.A tyrosine kinase is an enzyme that can transfer a phosphate group from ATP to a tyrosine resie in a protein. Tyrosine kinases are a subgroup of the larger class of protein kinases. Phosphorylation of proteins by kinases is an important mechanism in signal transction for regulation of enzyme activity.
4.There are over 100 3D structures of tyrosine kinases available at the Protein Data Bank. An example is PDB 1IRK, the crystal structure of the tyrosine kinase domain of the human insulin receptor.
5.Most tyrosine kinases have an associated protein tyrosine phosphatase.

‘叁’ 简述LANCE Europium assays检测蛋白激酶活性的原理和方法

比较专业，向老师和同学请教吧。
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。

‘肆’ 细胞质胸苷激酶的研究历史

1950s 胸苷激酶1被发现；
1980s 胸苷激酶1在世界范围内掀起研究热潮，美国、欧洲、日本均开始胸苷激酶1的相关研究；
1986 极富盛名的诺贝尔奖评审委员会所在的瑞典Karolinska医学院在Bernhard Tribukait教授（瑞典Karolinska大学终身教授，流式细胞技术发明者）的倡导下，成立了胸苷激酶1研究组，开始TK1的基础及应用研究；
1990s 胸苷激酶1活性检测方法及试剂盒问世，但是终由于操作方法的繁琐和对实体肿瘤灵敏度偏低等问题，在掀起一段热潮后终归沉寂；
1996 血清胸苷激酶1浓度免疫化学发光检测方法问世，解决了之前的实体瘤灵敏度偏低问题，同时免疫化学发光法更易操作，无放射污染；
2006- 血清胸苷激酶1检测再次掀起了医学临床研究热潮。

‘伍’ 纳豆激酶的研究历史

纳豆激酶的发现来自着名的两点半实验
1980年的一天，从事溶解血栓药物研究工作的日本心脑血管专家须见洋行博士，他突然想起纳豆不是纤维蛋白发酵的吗？而血栓最顽固的部分就是纤维蛋白，于是，下午两点半时，须见洋行博士把纳豆中提取的物质加入到人工血栓中。
原本准备第二天看结果的，但5点半的时候，一次偶然的察看，奇迹发生了，血栓居然溶解了2厘米，而平常用尿激酶做溶血栓的实验溶解2厘米需要近两天的时间，也就是说纳豆发酵物溶解血栓的速度是尿激酶的19倍之多。于是，就将纳豆的这种强力溶栓物命名为纳豆激酶Nattokinase，简称NK，这就是震惊世界的溶血栓药物研究史上有名的“下午两点半”实验。 株式会社日本生物科学研究所与韩国首尔延世大学研究院心脑血管疾病中心共同研究关于纳豆激酶对高血压的效果。该研究报告的结论是：“总之，纳豆激酶会导致收缩压和舒张压下降。这个结果表明增加纳豆激酶的摄入，可能对于预防和治疗高血压起着重要的作用。”该研究报告被国际权威学刊SCI收录(《Japanese society of hypertension》 VOL.31NO.8.August，2008ISSN0916_9636)。
株式会社日本生物科学研究所与印度孟买市TNMC&BYLNair医院共同进行的急性脑中风患者应用纳豆激酶+低分子肝素+抗凝药物治疗的综合临床研究。试验结论表明：纳豆激酶经口服摄取+低分子量肝素+抗血小板凝集药对于急性缺血脑中风的治疗效果显着。该研究报告也被国际权威学刊SCI收录(Jpn pharmacol ther vol.32 No 7 2004 TNMC&BYLNair 医院脑神经外科)。
株式会社日本生物科学研究所和日本圣玛丽安娜医科大学疑难疾病治疗研究中心共同进行关于纳豆激酶抑制血小板凝固和预防血栓形成的研究。该项研究的结论是：证实了纳豆激酶不但能溶解血栓，还能抑制血小板凝固，起到防范血栓形成的作用。这项试验结果于2003年3月在日本药学会发表。
此外，株式会社日本生物科学研究所还进行过纳豆激酶摄取后血液形态学的研究，手指血液流动变化试验对视网膜静脉塞栓试验、以及纳豆中维生素K2对华法令拮抗作用的研究。 据小笠原博士介绍，从医学的角度解析，纳豆激酶溶栓机理是：纳豆激酶通过刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，t-PA将纤溶酶原激活为纤溶酶，溶解纤维蛋白，直接溶解血栓；同时将人体内的尿激酶原激活为尿激酶，尿激酶与t-PA一同激活纤溶酶原，达到溶解血栓。
由此可见，纳豆激酶在直接溶解已经形成血栓的同时，还能激活增强人体自身的溶栓能力，从而起到持久平稳的溶栓作用。而且，小笠原博士又说：“纳豆激酶只溶解血栓的主体物质纤维蛋白，不水解血浆纤维蛋白原，所以不会引发出血的危险。”这一点是临床溶栓药剂所普遍缺失的。此外，进一步的临床研究发现，纳豆激酶还具有明显的降血压和抑制血小板凝集作用。 纳豆激酶(NattoKinase，NK)由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于 UK、SK、tPA的蛋白质，并可由肠道，吸收，纳豆激酶的体外、体内溶栓性质通过实验也已得到确定，同时得出纳豆激酶的体内溶栓活性为纤溶酶的四倍，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。患心肌梗塞的危险患者，一次需投入尿激酶30万单位，而50克的 纳豆中含有80万单位尿激酶的血栓溶解作用。(须见洋行等报道每克湿重纳豆约相当于1600尿激酶单位。)
日本圣玛丽安娜医科大学疑难病治疗研究中心和日本生物科学研究所最发现，纳豆激酶有抑制血小板凝固的作用，有助于预防高血压和动脉硬化。
据《日经产业新闻》报道，研究人员让接受实验者食用纳豆激酶的培养提取物，然后化验他们的血液。他们发现，食用这种提取物6小时后，实验对象血小板的凝固作用受到抑制。研究人员据此断定，纳豆激酶具有溶化血栓、使血流顺畅的功能。
因而，纳豆激酶成为一种新型的口服性溶血栓药物(第二代溶栓药)，在预防、治疗心脑血管栓塞症及栓塞性老年痴呆症等方面起到积极作用。 国际通用的标准含量标识FU
2010年12月20日，日本纳豆激酶协会与纳豆激酶专利所有者——日本生物科学研究所邀请中国国家医学教育发展中心在北京梅地亚中心召开新闻发布会，并发表声明：日本生物科学研究所是日本及全球最大的纳豆激酶原料生产企业，唯一拥有日本专利厅授予的纳豆激酶生产专利（专利号第3881494）。该研究所研制的纳豆激酶是通过纳豆菌培养液发酵产生纳豆激酶，经特殊的技术和工艺提取和提纯。以这种物质为主要原料制作而成的高纯度纳豆激酶产品具有溶解血栓作用，是现代生物领域的一项高科技产品，其安全性和有效性已经过医学临床验证，也得到日本纳豆激酶协会的充分认可。此外，日本官方健康营养食品协会制定的纳豆激酶产品的标准单位为“FU”，而非“IU”。
FU与FU/g的区别
纳豆激酶在国际上的标准单位为“FU”，是指每粒纳豆激酶产品的纳豆激酶含量；“FU/g”是指每克纳豆原料中的纳豆激酶含量，两者存在区别。

‘陆’ 请问测定AMP激活的蛋白激酶（AMPK）活性都有什么方法急！

可以通过分光光度计，或pH来测定!

磷酸腺苷
AMP—Adenosine monophosphate，翻译为腺嘌呤核糖核苷酸，也称为腺苷一磷酸或一磷酸腺苷。由一分子腺嘌呤、一分子核糖组成的腺苷，以及一分子磷酸组成。是在机体内由ATP与ADP释放能量之后形成的。可以继续结合磷酸基团形成二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP)
[编辑本段]氨苄西林
AMP—氨苄西林(Ampicillin的缩写),是一种抗生素.为广谱半合成青霉素，毒性极低。抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉素相同。对肠球菌及李司忒菌的作用则优于苄青霉素。对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉素酶的细菌均无抗菌作用。对革兰阴性菌有效，但易产生耐药性。
主要用于敏感菌所致的泌尿系统、呼吸系统、胆道、肠道感染以及脑膜炎、心内膜炎等。
[编辑本段]其他
HTML代码中＆符号的缩写便是AMP
APM=Actions Per Minute 就是每分钟操作的次数。它统计的操作包括了鼠标每次的左击，右击以及每次的键盘敲击。多见于星际争霸和魔兽争霸3（WAR3）这两款游戏中 APM的高低往往象征着玩家操作的精细程度，一定程度上反映了玩家的水平
AMP Amplifier 放大器
amplifier ['æmplifaiə] n. 放大器,扩音机
AMP-EN Amplifier Enable 放大器启动端
AMP-N Amplifier Negative 音频放大器信号负
AMP-P Amplifier Positive 音频放大器信号正
AMPC Amplifier Control 放大器控制

‘柒’ 如何探究细胞中某个蛋白激酶的活性

MPF即卵细胞促进成熟因子（maturation-promotingfactor），或细胞分裂促进因子。在成熟的卵母细胞、分裂期粘菌、酵母等中可提取到这种促细胞分裂因子。由两个亚基组成，一种是细胞周期蛋白，一个是依赖周期蛋白起作用的蛋白激酶，其中周期蛋白为调节亚基。能够促使染色体凝集，使细胞由G2期进入M期的因子。在结构上，它是一种复合物，由周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cdk）和G2期周期蛋白组成，其中，周期蛋白对蛋白激酶起激活作用，周期蛋白依赖性蛋白激酶是催化亚基,它能够将磷酸基团从ATP转移到特定底物的丝氨酸和苏氨酸残基上。酵母细胞周期中只有一种Cdk,而哺乳动物的细胞周期中有多种Cdk,所以哺乳动物的MPF是由Cdk1和周期蛋白B组成的复合物。有丝分裂期细胞与间期细胞融合后，会使间期细胞产生形态各异的染色体凝集，称作早熟染色体凝集。这一现象表明，分裂期细胞中可能存在某种诱导染色体发生凝集的因子。在成熟卵母细胞分裂期黏菌酵母等中提取到了这种促细胞分裂因子，称为成熟促进因子（Maturation-promotingfactor）。MPF是由催化亚单位和调节亚单位组成。催化亚单位是由cdc2基因编码的一类蛋白质，只有与调节亚单位结合后，才具蛋白激酶活性，促使细胞进入分裂期。调节亚单位是一类随细胞周期变化而周期性出现或消失的蛋白质，称为细胞周期蛋白，它具有细胞周期特异性及细胞类型特异性。MPF(M期促进因子或细胞促分裂因子或卵细胞促成熟因子)是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶，即CDK1激酶，由p34cdc2蛋白和周期蛋白B结合而成。CDK1激酶活性首先依赖于周期蛋白B含量的积累，随周期蛋白B浓度变化而变化：周期蛋白B一般在G1期的晚期开始合成，通过S期，其含量不断增加，随着周期蛋白B含量达到一定程度，CDK1激酶活性开始出现；到达G2期时周期蛋白B含量达到最大值，G2晚期阶段CDK1激酶活性达到最大值并一直维持到M期的中期阶段。CDK1激酶活性还受到激酶与磷酸酶的调节，活化的CDK1激酶可使的CDK1激酶活化。活化的CDK1激酶促使分裂期细胞在分裂前期执行下列生化事件：染色质开始浓缩形成有丝分裂染色体；细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体开始组装；高尔基复合体、内质网等细胞器解体，形成小的膜泡。

‘捌’ PKA（蛋白激酶A）的活性如何测定

目的研究蛋白激酶C(protein KinaseC,PKC)和蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)在甲状腺癌发生过程中的作用.方法利用酶的放射分析方法测定手术切除经病理证实的18例甲状腺癌患者和17例甲状腺癌患者手术切除的肿瘤组织中PKC和PKA活性水平.结果甲状腺癌组织中胞膜和胞浆PKC活性分别为7.280±2.380和7.397±4.065,PKA活性水平为1.716±0.923.甲状腺癌组织中胞膜和胞浆PKC活性分别为0.515±0.676和0.347±0.332,PKA活性水平为0.646±0.324.胞浆部分PKC与PKA活性比值:甲状腺癌组织为4.3;甲状腺癌组织为0.53.结论PKC与PKA均参入甲状腺癌细胞的增殖过程.

‘玖’ 请举一例简述蛋白质激酶催化反应的生物学意义

蛋白激酶（protein kinases）又称蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)。一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。磷酸化(由激酶催化)和去磷酸化(由磷酸酶催化)是控制细胞周期的关键。它们都被用来控制调控途径自身活性和执行调控途径决定的底物活性。细胞周期调控途径由一系列激酶和磷酸酶组成，它们通过将途径的下一个底物磷酸化和去磷酸化而对外来信号和检验点做出反应。途径最终显示的是通过控制M 期激酶(或S 期激酶)的磷酸化状态决定其活性。

M 期激酶的激活引发M 期的开始，它的失活是离开M 期必须的。这表明M 期激酶调控的活动是可转换的：细胞重新组织形成有丝分裂纺锤体要求底物磷酸化，返回到细胞间期状态要求同一底物去磷酸化。

M 期激酶作用的靶位是什么？细胞主要的重新组织发生在有丝分裂中，MPF 诱导有丝分裂的能力说明，M 期激酶直接或间接地引发这些活动。我们在后面讨论结构的重新组织，现在要探讨M 期激酶对多种蛋白质底物的作用是直接的还是间接的。对其作用有两种假设的模型:

它可能是磷酸化靶蛋白质的“主调控因子”，靶蛋白轮流作用调控其它必须的功能，一个典型的级联反应。

它可能是一个“工作室”，直接磷酸化执行调控功能或是周期中细胞重新组织所必须的决定性底物。

被M 期激酶磷酸化的底物唯一共有的性质是都存在一对Ser-Pro 序列，位于碱性残基的侧面(最常见的是Ser-Pro-X-Lys 形式)。潜在的底物依赖于体内M 期激酶准备磷酸化底物的能力，这些底物包括H1 组蛋白(可能是染色体凝集的需要)、核纤层蛋白质(可能是核膜溶解的需要)、核仁素(Nucleolin，阻断核糖体合成)和其它结构性酶活性。这些证据的力度不同，取决于在体内某种循环方式中哪个底物被磷酸化，以及M 期激酶是否是实际激活酶。然而，从多种底物中，M 期激酶似乎直接作用于那些有丝分裂中细胞结构改变涉及的多种蛋白质。

确定一个潜在底物在细胞周期中是Cdc2 的有效靶点的标准是什么呢？在体内相同的位点应被Cdc2 磷酸化，当Cdc2 被激活时，它就被磷酸化。体内Cdc2 被周期性磷酸化。理想情况下，体内Cdc2 激酶活性的突变可能阻止磷酸化，但目前仅在酵母中是这样。要做出这样的结论，磷酸化在细胞周期中是一个明显的活动，蛋白质的一些功能必须被磷酸基团的存在改变。这可以通过标记的磷酸化氨基酸的突变鉴定没有磷酸化是否阻止有丝分裂的功能。

Cdc2 激酶研究较多的底物是H1 组蛋白(组成染色质主要蛋白质的五种组蛋白质之一，见第19 章)。早就知道H1 在细胞周期中被磷酸化，在S 期加上两个磷酸基团，有丝分裂时再加上4 个磷酸基团。细胞主要的H1 激酶活性由M 期激酶提供。

细胞周期中磷酸化H1 的目的是一个值得思索的问题，因为没有直接表明它对染色质结构有影响。可能与M 期染色体凝集相关，可能为复制(可能需要解旋)或复制后的结果(为有丝分裂的开始做准备)做准备，这些假设是合理的，但在S 期这些修饰发生的时间尚缺乏了解。然而，H1 组蛋白的确是Cdc2 发动的激酶的很好底物，因此H1 激酶活性已成为检测体内激酶活性的常用方法。例如，这种检测对酿酒酵母很适用，通过检测H1 激酶活性评估M 期激酶的周期活性，尽管实际上这种酵母通常不含H1 组蛋白。

‘拾’ 纳豆激酶的选择方法

市场上纳豆激酶的种类太多，价格和品质参差不齐，很多人不知道如何选购，如何选择优质的纳豆激酶产品，可以参考以下四点进行购买。
一、产品是否符合国家食品相关部门规定？
纳豆激酶属于膳食补充剂，根据国家食品药品监督局规定，生产企业必须具有“生产许可证”，产品包装必须明确注明生产商、生产地址、条形码、QS生产许可、执行标准、主要成分表、营养成分等信息，缺少任何一项均属于违规的假冒伪劣产品。
二、产品或生产商是否拥有纳豆激酶行业的相关认证？
拥有国际国内纳豆激酶行业机构、国家级研究机构、国家食品药品行业等机构认证的纳豆激酶产品，比没有相关认证的纳豆激酶产品更具有权威性、规范性、安全性、有效性。
三、纳豆激酶的含量及标示是否符合国际标准？
含量是衡量纳豆激酶产品品质的标准之一。国际上规定：纳豆激酶的含量单位为FU/片，每日推荐服用量为2000-4000FU，且产品包装上必须注明真实含量，即每粒含多少FU；如包装上使用FU/g（纳豆激酶原料的单位）属于不符合行业规范的虚假行为，购买时需谨慎。
四、纳豆激酶的剂型是否安全?
胶囊/软胶囊：主要原料为明胶， 国内明胶行业鱼龙混杂，央视多次曝光毒胶囊事件，工业明胶中含有大量重金属元素，不利于人体健康。
片剂：采用植物提取物作为包衣，不含重金属元素。