⑴ 分子生物学 蛋白质磷酸化分析技术
在所 有 的 翻译后修饰中，可逆的磷酸化，几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神
经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。据统计，哺乳动物细胞内有三分之一以上的蛋白质可以被磷酸化川，蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。 真核 生 物 细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800:200:11 21。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此，一种蛋白可能有多种磷酸化形式。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点19待解决包括磷酸化蛋白和肤段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。1 磷酸化蛋白的识别
磷 酸 化 蛋白在细胞中含量甚微。在质谱分析中，磷酸化肚段的信号往往被非磷酸化肤段的信号所抑制。因而磷酸化蛋白和肤段的富集在提高磷酸化 位点的检测中占有非常重要的地位。
1. 1 磷酸化蛋白的富集
过 去 关 于 磷 酸化蛋白富集的方法主要应用针对特 定蛋白的抗体进行免疫沉淀。但该法需要首先对
蛋 白有所了解，且不适合大规模研究。虽然，近来关 于针对磷酸化基团的抗体已经出现，但只有抗磷
酸化酪氨酸的抗体效果较好[41。而抗磷酸化丝氨酸 、苏氨酸的抗体特异性均不强。近来，商品化的
磷 酸化蛋白提纯和富集试剂盒，在酵母中已成功应用，但在其它组织的应用还未见报道川。
1.2 磷酸化蛋白胶染色
检测 蛋 白 混合物中磷酸化蛋白的经典方法是先
行电泳分离蛋白质，然后用放射自显影术或针对磷
酸化蛋白的免疫印记方法来检测。近来，Pro-Q Diaround
磷酸化蛋白胶染色是一项重大的技术突
。破b]。这种特殊的荧光染料可以直接在胶内检测
针对磷酸化丝氨酸、苏氮酸和酪氨酸的蛋白，而不
需特殊的抗体或同位素标记。这种染色适用于
SDS-聚丙烯酸胺凝胶和二维聚丙烯酞胺凝胶，并旦
这种染色和后续的质谱鉴定是完全兼容的。SYPRO
Ruby染色是针对总蛋白的染色。通过每条泳带或
每个点的Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色
的比值，可以了解磷酸化蛋白在总蛋白中的比值。
两种蛋白染色结合使用，可以将高丰度蛋白的低磷
酸化状态与低丰度蛋白的高磷酸化状态区分开
2 磷酸化肤段的富集
磷酸 化 位 点的检测往往不是直接从蛋白水平检
测，而是从肤段水平检测。但由于L述提到的抑制
现象的存在，在分析之前应首先对磷酸化肤段进行
富集。
2.1 固定金属亲和色谱
目前 使 用 最广泛的分离和富集磷酸化肚段的方
法是固定金属亲合色谱(immobilized metal affinity
chromatography, IMAC)。此方法中，键合在鳌合
底物上的金属离子(如Fe3. , Gas. , Cue'等)选
择性地与磷酸化脸中的磷酸基团结合，在高pH值
或磷酸盐缓冲液中磷酸化肤可以释放出来。洗脱下
来的溶液经脱盐处理后可直接用于质谱分析。
IMAC通常可富集到磷酸化的酪氨酸、丝氮酸和苏
氨酸残基。但这种方法的局限性在于:可熊会丢失
掉一些低丰度的没有结合到IMAC柱上的磷酸化肤
段;具有多磷酸化位点的肤由于其较强的亲和力很
难被洗脱下来;某些酸性基团(如天冬氨酸和谷氨
酸)、电子供体文如组氨酸)也会结合到柱上·，造
成非磷酸化肤的污染。所以用IMAC方法富集磷酸
化肤的效果如何，绝大部分依赖于所选择的金属离
子、填充柱的材料、及洗脱的程序。最近，Ficarro
等[C1在IMAC富集以前，将肤的酸性残基进行酷化
处理，使其特异性大大提高，预期对大范围磷酸化
分析具有广阔的前景。
2.2 磷酸化肚段的化学修饰
近来 ， O da等[1-1将肤或蛋白混合物置于碱性硫
代二乙醇溶液中，通过P2消除从磷酸化丝氨酸或
苏氨酸中去掉磷酸基团H3P0 ,，形成的双键受到硫
代二乙醇的作用，琉基取代磷酸根。生物素与琉基
相连，被标记的肤或蛋白质上样于固定有亲和素的
层析柱，通过生物素与亲和素的高亲和力作用而达
到磷酸化肤或蛋白质富集的目的。这一方法的主要
缺点在于它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白质和肤。
Zhou等I〕用另外一种方法修饰磷酸化肮，用碳二
亚胺浓缩反应将半胧氨酸加在磷酸盐部分，修饰过
的肤段以共价键与碘乙酞胺树脂结合，酸洗涤释
放。此方法既可用于富集磷酸化酪氨酸也可用于富
集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸，但需要许多步化
学反应和柱纯化过程。
⑵ 简述检测蛋白质磷酸化的检测方法及其原理
1、我看过一篇外文文献，上面有提到直接用SDS-PAGE观察是否磷酸化，对照组将待测蛋白的磷酸化酶（不是磷酸酯酶）失活，试验组保证磷酸化酶处于活性状态，之后比较两待测蛋白的电泳结果，通常试验组会出现紧挨着的两条带。
2、pull
down(见本人的网络空间，一下自己搜一下，不再赘述）
immunoprecipitation
yeast
two-hybrid
phage
display
...
⑶ 如何检测蛋白是否发生磷酸化
有磷酸化的抗体，
磷酸化抗体可以识别蛋白质的磷酸化或者非磷酸化形式，而且可以在避免放射污染的情况下，对磷酸化蛋白进行定性和定量分析，因此特异性磷酸化抗体是研究蛋白质磷酸化的重要工具。