上海水体微生物测序分析方法

Ⅰ 如何采用宏基因组进行水产动物肠道微生物的研究

1，宏基因组提取；提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，除需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样本的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持DNA 片段的完整和纯度。为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集，常用的富集方法有稳定同位素探针、抑制性消减杂交、差异显示、噬菌体展示、 亲和捕获及DNA微阵列等技术。
2，测序分析：
采用Solexa进行宏基因组 DNA测序，首先对特定环境微生物种群全基因组DNA进行提取。在提取微生物种群的DNA后制备DNA文库，具体步骤如下：

（1）将DNA随机打断成200-500bp的片段；

（2）对DNA末端进行修复；

（3）将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；

（4）在DNA片段的末端加上接头；

（5）纯化连接产物；

（6）PCR扩增连上接头的DNA片段；

（7）检测测序文库。

Ⅱ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

Ⅲ 微生物研究有哪些高通量测序手段

如芹悉高何读懂微生物测序数据质量宏基因组是指特定环境中全部生物（微生物）遗传物质的总和。宏基因组测序是利用高通量测序技术对环境陆迟样品中全部微生物的基因组进行测定，以获得单个样品的饱和数据量，可进行微生物群体的基因组成及功能注释，微生物群体的物种分类，多样性分析，群落结构分析，样品间的物种或基因差异以及物种间的代谢网络研究，探索微生物与环境及宿主之间的关系，发掘和研究新的具有特定功能的基因等。与传统方法相比，基于高通量测序的宏基因组研究无需构建克隆文库，这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进嫌尺行克隆而引起的系统偏差，简化了实验操作，提高了测序效率。此外，宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制，扩展了微生物资源的利用空间，为环境微生物群落的研究提供了有效工具。通过宏基因组深度测序可以揭示或估计环境中真实的物种多样性和遗传多样性，挖掘具有应用价值的基因资源，应用于开发新的微生物活性物质，为研究和开发新的微生物活性物质提供有力支持。

Ⅳ 微生物多样性（扩增子/16S rDNA测序）—α多样性分析方法描述

​一、α多样性指数分析内容及意义

a) 群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析（α[Alpha]多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物亏空种丰度和多样性。 

b) α多样性指分析主要包括：

①菌群丰度（Community richness）指数计算：Chao、Ace指租空拦数；

②菌群多样性（Community diversity）指数计算：Shannon、Simpson指数。

    ——获弊胡得指数计算汇总表格。

稀释性曲线（Rarefraction Curve）；Shannon-Wiener曲线；Rank-Abundance曲线；Specaccum曲线

二、α多样性分析在科技论文中的描述

a) 稀释性曲线和Shannon-Wiener曲线结合使用：

例如1：Shannon and Rarefaction analysis showed that, although new phylotypes can be obtained by additional sequencing, most of the gut microbial diversity in each sample was captured with the current sequencing depth. After rarefying the sequencing depth among all the samples using bootstrap (XX,XXX reads per sample), Shannon diversity index and rarefaction OTU estimates were calculated. There was no significant difference in the richness (as indicated by rarefaction OTU estimates) and diversity between Group A and Group B in this study.

如有显着差异：while Group B significantly reced both the richness and diversity of the microbiota(P<0.05 OR Show in fig.)。

  例 如2：The richness of oral bacterial communities in three oral habitats of periodontitis patients and the control cohort were estimated by rarefaction and Chao 1, and diversity was estimated by Shannon diversity index and Simpson diversity. The shape of the rarefaction curves indicated new phylotypes would be expected with additional sequencing. However, the Shannon diversity index curves of all samples reached plateaus with the current sequencing, suggesting that most diversity had already been captured.

b) Rank-abundance曲线：

例如1：Rank-abundance curves reflect the fact that a few dominant phylotypes comprise the major proportion of the A communities whereas a more even community is seen in XXX.

例如2：Bacterial communities were also similar in their structure, exhibiting comparable trends for both rank frequency and abundance across the soils sampled.

c) 物种累积曲线：

例如：According to the sample number and species OTUs, we calculated the species accumulation curve of all participants. In this study, the curve had reached a plateau, and the species had no more obvious increase as the sample number increased, which indicated that the sample volume in our study was relatively large enough to reflect the species richness.

d) α多样性指数比较：

  例 如：We compared the α-diversity of microbiota between XX and XX samples using the chao1, ACE, observed species, Shannon and Simpson index, and found that all five indexes showed significant difference (P = XXX, XXX, XXX, XXX, and XXX, respectively). The XXX samples had a significantly higher α-diversity.

温馨提示：

文章写作时，使用α多样性指数种类和方式，需根据文章表述需求进行选择，因此， α多样性指数的差异分析需根据提供的α多样指数汇总表自行完成。

Ⅳ 微生物16S测序数据分析思路解读

文章摘录： https://metagenome.blog.csdn.net/article/details/106435898?utm_medium=distribute.pc_relevant.none-task-blog--1.control&dist_request_id=1328680.10001.16161359172342727&depth_1-utm_source=distribute.pc_relevant.none-task-blog--1.control

16S rRNA基因测序（也称16S rDNA测序）是最常用的菌群多样性分析的手段。对于新手，如果收到一份不讲“人话”的16S测序分析报告，很快就会被各种生态学术语、各种指数、各种分析方法弄晕。

7个问题串起16S测序的核心结果

怎么办？用你的研究逻辑来梳理16S测序数据（图1）。

简单地说，做16S测序是为了鉴定样本中的微生物（细菌）群组成，找微生物群与疾病或表谨睁贺型的相关性。

详细地说，

1）首先想了解在不同组样本中各有哪些微生物存在和丰富度（对应于菌群鉴定和α多样性分析）；

2）接着想看不同样本组间微生物群组成是否存在差异（对应于β多样性分析）；

3）如果是，那么就有必要找出引起不同组样本微生物群差异的关键菌。如果不是，那说明微生物群比如肠道菌群与疾病或表型可能并不相关（基于已有的研究，这种可能性比较小）；

4）找到了关键菌，在临床上，很自然会想到，这些（个）关键菌是否可以作为Biomarker（对祥派早态应于疾病诊断模型构建），比如用于区分糖尿病前期患者与健康组的标志物；

5）以及这些（个）菌是否与临床指标具有相关性（对应于菌群与临床指标的相关性分析）；也会进一步想到，既然不同组的微生物群落存在差异，又与疾病具有相关性，

6）那么这些菌群是如何影响宿主的，可能参与了哪些代谢途径（对应于菌群基因功能预测）；

7）这些预测到的菌群功能是否与疾病有关，通常是肯定的。最后把这些结果整合起来分析，可以初步得出菌群组成的变化是如何与疾病或表型相关的。

顺着上述7个生物学问题来看16S测序结果，你会轻松拨开迷雾，直达核心结果。

Ⅵ 做生产用水微生物的细菌总数和大肠菌群德检测依据是什么

一、水质微生物及指示菌

在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长，因此水体是仅次于土壤的第二种微生物天然培养基。水体中的微生物主要来源于土壤，以及人类的动物的排泄物及污染。水体中微生物的数量和种类受各种环境条件的制约。

一般认为，水中微生物以革兰氏阴性杆菌占有较大优势。与其他水体相比，河水及溪水中革兰氏阳性菌相对较多，这是因为陆地微生物冲洗污染的缘故。

水体中的致病性微生物一般并不是水中原有微生物，大部分是从外界环境污染而来，特别是人和其它温血动物的粪便污染。水中常见的致病性细菌主要包括：志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、小肠结炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌等。

在实际控制中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对各种可能存在的致病微生物一一进行检测，而一般利用对指示菌的检测和控制，来了解水体是否受到过人畜粪便的污染，是否有肠道病原微生物存在的可能，从而评价水的质量，以保证水质的卫生安全。

目前，世界各国一般认为大肠菌群是指示水质受粪便污染较好的指示菌。

我国水质控制也采用大肠菌群作为指示菌，GB5749-85《中华人民共和国国家标准
生活饮用水卫生标准》规定，生活饮用水中大肠菌群每升不得超过3个。

在某些情况下，水体中的细菌总数也可指示水体受粪便等污染物污染的情况。这里的细菌总数其实是指营养琼脂培养后形成的菌落总数。目前世界各国对于控制饮用水的卫生质量，除采用大肠菌群等指标外，一般还采用细菌总数这个指标。我国GB5749-85《中华人民共和国国家标准
生活饮用水卫生标准》中规定生活饮用水细菌总数每毫升不得超过100个。

二、水质微生物检验方法

GB5750-85《中华人民共和国国家标准 生活饮用水标准检验法》提供了水质中细菌总数和总大肠菌群的检测方法。

（一）细菌总数的检测：

国家标准中，细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。

对生活饮用水，直接吸取1ml水样于平皿中，加入营养琼脂后混匀，37℃培养24h，进行计数。

对水源水，根据情况对样品进行10倍梯度稀释，选择适宜稀释液1ml，加注平皿，营养琼脂混匀，37℃培养24h，进行计数。

按照规定格式报告每毫升水中细菌总数。

（二）总大肠菌群的检测：

国家标准中，利用总大肠菌群作为粪便污染的指标。总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的，37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。

国家标准提供了多管发酵法及滤膜法检测总大肠菌群的方法。

多管发酵法检测总大肠菌群，分为三步：初发酵试验，平板分离，复发酵证实试验。初发酵试验，采用乳糖蛋白胨培养液37℃培养24h，观察产酸产气情况。对阳性管培养物，接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基，观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验，并根据标准所附检数表报告结果。

其中，对生活饮用水，初发酵试验接种水样总量300ml，即100ml接种2管，10ml接种10管，采用两个稀释度，12支发酵管。对水源水，初发酵试验接种水样总量55.5ml，即10ml接种5管，1ml接种5管，0.1ml接种10管，共采用三个稀释度，15支发酵管。两种接种方法，所用的检数表是不同的。

滤膜法检测总大肠菌群，就是利用微孔滤膜，过滤一定量水样，将水样中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜帖放在选择性培养基上（如品红亚硫酸钠培养基），经培养和证实试验后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，并计算出每升水样中含有的总大肠菌群数。

三、说明：

1．菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行。生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养。

2．培养时间。与食品中菌落计数不同，测定水中细菌总数，培养时间采用24h。

3．总大肠菌群的测定方法，由于饮用水和水源水可能的污染程度不同，因此采用不同的接种量，检数表也不相同。

4．当接种量超过1毫升时，一般采用多倍浓度培养液。如配制3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液50mL，加入100mL水样后，总体积为150mL，培养液恢复到正常浓度。

5．滤膜法检测总大肠菌群，一般在检测较大量低浊度水样时采用，大量水样滤过滤膜后，水中所含有的所有细菌均截留在滤膜上。

Ⅶ 环境微生物测序采样指南

随着高通量测序技术飞速发展，人们对微生物的认知也在逐渐深入。凌恩生物每天都会接到全国各类型微生物测序样本，上到山巅土壤，下至深海底泥；有老师研究植物根际和叶内微生物，也有老师关注动物昆虫肠道生理代谢的奥秘。为了得到能够研究的测序结果，规范标准的取样及送样是成功的前提。

在样本送测前，我们要注意以下几点：

1、取样使用的工具及容器必须经过灭菌处理；

2、取样后及时做好标记，记录取样相关信息；

3、样本送测前做好备份，防止意外发生丢失珍贵样本；

4、送测样本使用标准容器承装，在容器上标记清晰，送样不宜过多；

5、寄送时保持低温环境，建议使用干冰配送；

6、可使用凌恩微生态样本保真液，高品质样本是决定高品质研究成果的第一步。

常规土壤类样本取样方法-农田/森林/草原土壤等

(1) 取样方法

按实验设计确定采样范围，取样器具需事先消毒灭菌处理。采样时应去除地表杂质，根据需要挖取相应深度（如5~20 cm）的土壤，置于冰磨拍掘上运至实验室。去除可见杂质，建议过2 mm无菌筛网。同一样方多点样本等量混合均匀后取5~10 g，保存无菌EP管中，进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司。

注：建议戴一次瞎核性手套、口罩，进行严格贺敬取样和操作，尽可能减少人为的污染。

根际土壤样本取样方法-作物/蔬菜/草木根系等

（1）作物类（含草地等矮小植物）根际土壤取样方法

a. 采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室；

b. 晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤；

c. 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

（2）林木类根际土壤取样方法

a. 采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室；

b. 过 2-5 mm 孔径无菌筛网；

c. 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。

注：取样器具请事先消毒灭菌处理。若为真菌根际土壤，请务必尽可能去除菌丝体残留，减少对 DNA/RNA 提取的干扰。

植物表面微生物取样方法

（1）取样方法

依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。植物根部组织可以通过摇晃振荡或无菌刷子去除根表粘附土壤。

（2）样本前处理

将植物组织浸没于无菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，超声波洗涤10min（参数：160 W，30s/30s），最后取出植物组织至于-80度冰箱保存备用。

将三次洗涤液汇总，过0.2um滤膜（或12000g离心10min，收集沉淀），收集滤膜至于-80度冰箱保存。

植物内部微生物取样方法

（1）依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。

（2）对植物组织进行表面消毒操作或者使用上一步“ 植物表面微生物取样”中处理过的植物组织，液氮速冻后，研磨成粉，即可用来进行核酸的提取。

植物组织表面消毒具体操作如下：

无菌水洗涤30s，70%无菌乙醇洗涤2min，2,5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5min后转移至70%无菌乙醇浸泡30s，最后使用无菌水洗涤植物组织3次，即视为对植物组织表面进行无菌化。

表面无菌化的植物组织至于-80度冰箱保存备用或进行核酸提取。

植物根表面微生物取样方法

（1）将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中；

（2）加入PBS缓冲液后进行振荡，使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液当中,震荡至少2h以上；

（3）直接提取PBS缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA的提取。

PBS浓度和PH有要求：浓度是用1x的，PH值是7.4，一般买回来的PBS是10x的，建议稀释到1x。

注意： 建议优先使用超声波洗涤 。

空气样本微生物取样方法

使用空气抽滤机，使空气通过 0.22 μm 滤膜，滤膜上有可见覆盖物（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），收集完成后取下滤膜。滤膜置于冻存管中，液氮速冻，干冰寄送到实验室。

注意：由于样本特殊，微生物含量较少，建议多保管备份保存。

水体样本微生物取样方法

送样量：扩增子直径3-4cm滤膜1-2张；宏基因组直径3-4cm滤膜>=2张；

（1）研究目的进行确定水体的取样深度和范围；

（2）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45μm的滤膜，取样体积大于5L；对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤；

（3）水体泥样的采集提供大于5g样本；

（4）用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

注意：扩增子项目将2-3L水体过滤到1-2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中；宏基因组项目将10L水体过滤到>=2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中。

活性污泥与水体/地表沉积物类样本取样方法

（1）活性污泥

从活性污泥装置中取大于10 ml的悬浮污泥样本（约5-10 g沉降物），保存无菌EP管中，放入液氮或置于冰上，立即运至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。

注：若液态污泥样本沉降物较少，可适当增加取样量。

（2）水体/地表沉积物

取距离水底/地表0-10 cm（具体按实验需要而定）的沉积物5~10 g，保存无菌取样袋或EP管中，置于冰上运送至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。