1. wb实验目的条带就(一定比内参细吗
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和顷毕衡抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。
所以，严谨 的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)，空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)，已知量标准产物的正对照;另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。
我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要数运进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA 的干扰;且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂(如DTT，巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。 在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞 中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否 完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
实验雀做结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得 到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分， 可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止;若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
附：在Western blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
2. wb条带怎么分析粗细深浅
根据蛋白质表达量分析。wb就是艾滋病抗体确证试圆搜验，主要是监测env的条带，只要出现两个env条带，就可以判橘桐历定是阳性，所以主要是检测env条带。wb条带粗细深浅表示蛋白质表达量，所以粗细深浅根据蛋白质表达量分析。蛋白质表达量是包含蛋白质的聚集体形态、单体形态和含有fc的片段的加和值。轮哪
3. graphpad prism分析WB条带
打开Image J软件导入WB条带图片：File→Open→找到郑厅WB条带把图片转化成灰度图片：Image→Type→8-bit。消除图片背景的影响：Process→Subtract Background，在弹出的对话框中，填上50基本就可以了，并勾上Lightbackground，点击OK。此时图片背景会变白一些。设置定量参数：Analyze→Set Measurements。在弹出的对话框中勾选Area、Mean grayvalue、Min& max gray value、Integrated density。设置单位：Analyze→Set Scale。在弹出的对话框“Unit of length”后面填上“pixels”，其他的不用改动。把WB图片转换成亮带：Edit →Invert选择菜单栏下的不规则圆形工具，将圆圈手动拉倒第一条带，并尽量将条带都圈起来。点击菜单栏Analyze下拉出现的measurement，即可弹出你选定区域的灰度统计值。也可以点击快捷键英文状态下的键盘m手动移动不规则圆圈至下一条条带，重复8、9步骤，直至所有条带都被测量当测定完所有条带，选结果中的“Edit”的“Select All”，然后闹启复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析。也可以直接在Results对话框中，选择File →Saveas，直接导出excel表格在excel表格中将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处GraphpadPrism软喊弯隐件中作柱状图。
4. wb电泳时条带不齐
wb电泳时条带不齐的姿败原因：根据银薯自己做的经验锋册者提供一点建议:胶是否是新配的，能先用小电跑，尽量让条带跑齐，再换大电压。板和架子没合严，两板之间的液面一部分已经低于薄板完成了部分断路，跑一会停一下打开看看，补下缓冲液试试。
5. wb条带颜色调深
1、首先打开photoshop软件，在激配改主界面将wb条带图片导入。卖薯
2、其次在上面功能选项中，点击灰阶处理，将wb条带调整到背景全白，中和灰色阶调，强化深色区段为纯黑色，把淡色范围大幅度降低明度。
3、最后将灰度值调到10%，wb条带的颜明判色就会变深。
6. wb条带分析
ImageJ的软件界面
1.ImageJ对WB条带进行灰度分析
1）File|Open打开WB结果图片
2）图片类型设置：Image|Type|8bit
3）去除图片背景：Process|Subtract Background
在Subtract Background窗慎腊口按照以下条件进行设置：
4）设置定量参数：Analyze |SetMeasurements,点击Area，Mean Gray Value及Integrated Density
5）设置单位: Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里输入“宽悄滑pixels”
6）将图片转换成亮带运冲，Edit|Invert
7）选择Freehand Selection,尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值
8）复制数据IntDen进行分析
7. ppt怎么把wb条带拉直
选取待调曲线，右键编辑顶点。
右键编辑顶点，在此基础上右键，删除顶点，逐一删除，只剩两个端点。先选中所有点直线，再击绘图工具的下皮培拉箭头（一般在左下角），对齐或分布，然后再在里面找到你想要的对齐方式，如：右对齐，垂直分布，水平分布等。
这个组缓做织架构图一开始自动生成的下方扰握衡都是直的吧。你试着把不整齐的删掉重新添加。
8. 跑的western条带很脏怎么解决
western条带很脏可通过尝试使用以下方法解决：
1、过滤封闭液或选用其漏清喊他类型封闭液；
2、与其他品牌已验证过好用的抗体处理相同样本，作比较，看是否还有斑点；
3、更换试剂。
western条带显影脏，一般由以下原因造成：
1、封正洞闭液溶解不完全或封闭液存放时间太久；
2、抗体返野中可能存在杂质；
3、试剂污染。
9. 如何ps修改western条带的灰度值
Western Blot是一种对蛋白进行定性的分析方法，属于常规实验操作，其数据处理是必不可少的一步。目前，发表的实验性文献中大多要求包含WB的半定量分析数据。今天，小编给大家介绍用PS进行灰度分析及之后的数据作图处理。
使用软件本文中使用的软件为Photoshop CC，其他版本的Photoshop，操作步骤基本相似。1、在PS中打开western blot图片2、设置参数，在图像-分析-选择数据点，选择灰度值（信物平均），其他选项可取消3、处理图片，图像-调整-反向4、灰度测量，使用魔棒工具点击要分析的条带，下面会显示出灰度值5、导出数据，点第一行后按住shift键，点最后一行进行全选数据，导出数据6、在Excel表格中计算目的蛋白和内参蛋白的平均灰度值，用平均目的蛋白除以平均滑仿液内参蛋白；得到多组比值后，用GraphPad绘制柱状图（大正其他软件也可以）7、GraphPad绘制柱状图的过程，8、得到柱状图
10. WB相关技巧--quantity one软件调节内参
1.跑WB 有时碰历候不想做PCA定量怎么调节内参呢？
解答：有老司机认为凭借经验可以用肉眼看出来差异，可是对于新手来说总不能做个几百次才像他们获得经验吧，这时候定量就是急需的内容了，对不对？ 解决方法呢？ 一般可以用image J 软件笑纳搜或者quantity one软件进行操作， 原理为 ：image J 是依据灰度值（也就是白色到黑色的颜色变化程度茄知）进行的调节；quantity one是依据密度或者体积（也就是条带的大小）； 结果： quantity one 貌似用体积方法好用一点点。
流程如下：打开quantity one 软件 之后导入图片（tiff文件，之前试跑的条带），
结果为：