武汉肠道微生物多样性分析方法

① 微生物多样研究—微生物深度分析概述

一、微生物深度分析方法核心思想

复杂微生物群落解构的核心思想：

不预设任何假定，客观地观测整个微生物组所发生的一系列结构性变化特征，最终识别出与疾病或所关注的表型相关的关键微生物物种、基因和代谢产物。

二、微生物深度分析方法—关联分析

进行微生物群体关联分析，需要结合两大类传统的统计分析方法：

   1）无监督学习（Unsupervised learning）

   2）有监督学习（Supervised learning）

无监督学习： 基于对数据结构的自然分解和观察。

主要包括以下三类方法：

   1）主成分分析（Principal component analysis，PCA）；

   2）多维手腔颂尺度分析（Multidimensional scaling， MDS）；

   3）聚类分析（Clustering analysis）

有监督的学习： 则是基于某种已知的样品间相互关系，尽可能地按照这种关系提取原始数据中的相关信息。

传统的有监督学习方法包括：

 冗余分析（Rendancyanalysis，RDA） 

 典型相关分析（Canonicalanalysis） 

 偏最小二乘判别分析（Partialleast squares discriminant analysis，PLS-DA） 

 ……等约束排序方法（Constrainedordination）。

三、微生物深度分析方法—多维度结合分析

※ 考虑微生物群落成员之间的系统发育关系，可以将这些有监督的学习方法与无监督的多维尺度分析相结合。

即：把通过给定样品间距离进行线性变换分解得到的新变量用于有监督的学习。

由此衍生出基于距离的冗余分析（Distance-basedrendancy analysis，db-RDA）和主坐标典型相关圆缓分析（Canonical analysis of principal coordinates，CAP）

 ▲  通过约束排序，可以对群落样品间的相互关系是否遵循已知样品分布规律做出判断。

四、随机森林算法

随机森林（RandomForests）方法找寻关键变量。 

随机森林：是一种基于决策树（Decision tree）的高效的机器学习算法，可以用于对样品进行分类（Classification），也可以用于回归分析（Regression）。  

随机森林属于非线性分类器，因此可以挖掘变量之间复杂的非线性的相互依赖关系。

五、ROC曲线

接收者操作特征曲线（Receiveroperating characteristic curve，ROC曲线）也是一种有效的有监督学习方法。  

ROC 分析属于二元分类算法，用来处理只有两种分类的问题，可以用于选择最佳的判别模型。

六、LEfSe分析

LEfSe分析： 基于线性判别分析（Lineardiscriminant analysis，LDA）效应量（Effectsize）的分析方法。

本质是将线性判别分析与非参数的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和检验相结合，从而筛选关键的生物标记物（也就是关键群落成员）。

七、基于微生物成员之间的网络推断分析

这类分析的 根本目的 ：考察不同群落成员之间的相互作用，通过关联分析的方法，找寻群落成员在不同生境下共同出现（Co-occurrence）或彼此排斥（Co-exclusion）的相互作用模式，从而推断不同微生物类群之间可能的“协作”或“竞争”关系。

八、基于微生物成员之间网络推断分析的延伸和发展

发展延伸的领域： 肠道元基因组学 领域的一系列研究又在此概念的基础上更进一步，发展出了

“丰度共变化的基因类群”（Co-abundance genegroups，CAGs）

“元基因组学物种”（Metagenomic species，MGS）

……等新名词，对于阐释元基毕郑因组学的复杂数据提供了全新的思路和办法。

② 微生物多样研究—β多样性分析

一、β-多样性分析

1. 样品间距离计算

样品间的物种丰度分布模辩迅差异程度可通过统计学中的距离进行量化分析，使用统计算法Euclidean，Bray-Curtis，Unweighted_unifrac，weighted_unifrac等，计算两两样品间距离，获得距离矩阵，可用于后续进一步的beta多样性分析和可视化统计分析。 ​

例如：将距离矩阵使用热图表示可直观观察样品间的差异高低分布。

2. PCA 分析

主成分分析(PCA，PrincipalComponent Analysis)，是一种应用方差分解，对多维数据进行降维，从而提取出数据中最主要的元素和结构的方法。  

应用PCA分析，能够提取出最大程度反映样品间差异的两个坐标轴，从而将多维数据的差异反映在二维坐标图上，灶搏进而揭示复杂数据背景下的简单规律。  

如果样品的群落组成越相似，则它们在PCA图中的距离越接近。

3.  PCoA分析

主坐标分析（PCoA，PrincipalCo-ordinates Analysis），是一种与PCA类似的降维排序方法，通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构。  

可以基于bray_curtis、WeightedUnifrac距离和UnweightedUnifrac距离分别来进行PCoA分析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示。  

如果样品距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落差异很大的样品则会远远分开。

※   当PCA或PCoA分析的前两个成分（解释度）较小（如pc1与pc2之和小于50%）时，可尝试将前三个成分用于对假设因素进行验证，并作三维图来反应样品间群落组成的关系。

4.  NMDS分析

非度量多维尺度分析（NMDS分析）是一种将多维空间的研究对象（样品或变量）简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法。 

适用于无法获得研究对象间精确的相似性或相异性数据，仅能得到他们之间等级关系数据的情形。

基本特征是将对象间的相似性或相异性数据看成点间距离的单调函数，在保持原始数据次序关系的基础上，用新的相同次序的数据列替换原始数据进行度量型多维尺度分析。换句话说，当资料不适合直接进行变量型多维尺度分析时，对其进行变量变换，再采用变量型多维尺度分析，对原始资料而言，就称之为非度量型多维尺度分析。

特点是根据样品中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上，而对不同样品间的差异程度，则是通过点与点间的距离体现的，最终获得样品的空间定位点图。

5. 多样品相似度树状图

利用树枝结构描述和比较多个样品间的相似性和差异关系。 

首先使用描述群落组成关系和结构的算法计算样品间的距离，即根据beta多样性距离矩阵进行层次聚类（Hierarchicalcluatering）分析，使用非加权组平均法UPGMA（Unweightedpair group method with arithmetic mean）算法构建树状结构，得到树状关系形式用于可视化分析。

6.  PLS-DA分析

PLS-DA（PartialLeast Squares Discriminant Analysis）分析是以偏最小二乘回归模型为基础，作为一种有监督的模式识别方法，根据给定的样品分布/分组信息，对群落结构数据进行判别分析。 

PLS-DA通过寻找物种丰度矩阵和给定的样品分布/分组信息的最大协方差，从而在新的低维坐标系中对样品重新排序。

PLS-DA可以减少变量间多重共线性产生的影响，因此，比较适合用于微生物群落数据的研究。

分析时，会计算每个物种的VIP（Variableimportance in projection）系数（VIP值需>1，值越大，说明该物种对于组间差异的贡献越大）

7.组合（变换）分析图

特点： 

集多种分析结果于一身组合成图，即一整图表解释多种生物学意义。 

展现形式、分析名称发生变化并进行重新调整，但所表述的生物学意义未变化旦此。 

具有一定的观赏性。

  分析形式多种多样，但万变不离其宗。

例如：样本聚类树与柱状图组合分析

③ 肠道菌群检测是什么如何检测

肠道菌群检测是通过对人体粪便的提取物检测肠道菌群状况，比例是否正常，存在哪些问题和风险。对于前述适应症疑似患者，治疗前均需进行肠道菌群进行多项常规生物指标检测，以初步判断患者肠道菌群状况。

在进行此基础上，进一步对疑似患者进行肠道菌群基因检测，并对结果进行详尽解读，以便给患者菌群移植治疗制定个性化精准菌群移植治疗方案。

④ 医院怎么检查肠道菌群

肠道菌群有两种检查方法。(一)菌群检查为主要检查方法，有定性分析和定量分析两种。(1)定性分析，与一般微生物检查方法相同，定性分析后，要进一步做定量检查。(2)定量检查，手续麻烦，一般实验室很少采用。(二)结肠镜检查：有散在的糜烂性溃疡及出血，有时可能会见黄色假膜附着。如果症状严重者建议去医院诊断及治疗。
肠道内种类繁多的细菌之间相互作用以维持肠道正常菌群的稳定性。肠道中需氧菌和兼性厌氧菌消耗氧气，有利于专性厌氧菌生长。专性厌氧菌过度繁殖反过来抑制需氧菌生长，进一步抑制厌氧菌自身繁殖。这些细菌还通过各种代谢产物互相影响，起到自身调节作用。有些学者将胃肠道菌群分为原籍菌（或称常住菌群或固定菌群）和外籍菌（或称过路菌群或游动菌群），正常菌群是以原籍菌为优势菌群，外籍菌参与组成，外籍菌在人体中数量少而且不稳定。当肠道内一些原籍菌由于失去制约而过度生长叫肠道菌群失调。

⑤ 研究肠道微生物有哪些方法与技术

研究肠道微生物有哪些方法与技术
肠道微生态系统是哺乳动物健康与疾病的重要基础,在生理、病理、预防、治疗中都具有重要的地位和作用[1]。对于哺乳动物,肠道微生物的营养作用非常重要,如合成维生素、消化碳水化合物、氨的利用、脂的利用以及合成酶类[2]。在食物相对缺乏时,肠道多形类杆菌对糖苷水解酶的分泌会增多,提高肠道微生物群系利用食物的能力[3]。可见,肠道微生态系统能根据食物的特点做出改变,以其功能的多样性和较大的适应性来应对外界环境的变化。人体肠道微生物群基因的多态性还为宿主提供了许多人体自身所不具备的酶与生化途径,从而使得人体不易消化的食物残渣及上皮细胞分泌的内生粘液被发酵利用[4]。为探寻肠道微生物在机体的营养与健康以及疾病与治疗机制中的作用,越来越多的科研工作者开始关注对肠道微生物的研究[5,6]。悉生生物学、厌氧培养技术、电镜技术、细胞分子生物学、基因组学、代谢组学及蛋白质组学等现代科学技术的发展对肠道微生态的研究起到了积极的推动作用[7,8]。在Biolog等研究方法中,需先将肠道中的微生物提取出来,所得到的菌悬液,既保证活体微生物的种类和数量,又去除可能会干扰研究结果的杂质[9]。

⑥ 微生物多样性alpha分析看不明白看这里！

在微生物多样性分析的报告中主要包括五个部分：Alpha多样性分析、Beta多样性分析、物种组成分析、进化关系分析、差异分析，其中Alpha多样性分析是生态学中生物多样性的一个重要的组成部分，也是比较基础的一部分。

Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标。Alpha多样性主要与两个因素有关：一是种类数目，即丰富度；二是多样性，群落中个体分配上的均匀性。群落丰富度（Community richness）的指数主要包括Chao1指数和ACE指数。群落多样性（Community diversity）的指数，包括Shannon指数和Simpson指数。另外，还有测序深度指数Observed spieces 代表乎旦OTUs的直观数量统计, Good’s coverage 指计算加入丰度为1 的OTUs数目，加入低丰度影响。

Alpha多样性各指数的意义

Chao1： 是用chao1 算法估计群落中含OTU 数目的指数，chao1 在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物种总数越多。Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)，其中Schao1为估计的OTU数，Sobs为观测到的OTU数，n1为只有一条序列的OTU数目，n2为只有两条序列的OTU数目。Chao1指数越大，表明群落的丰富度越高。

Ace： 是用来估计群落中含有OTU 数目的指数，同样由Chao提出(Chao and Yang, 1993)，是生态学中估友顷庆计物种总数的常用指数之一。默认将序列量10以下的OTU都计算在内，从而估计群落中实际存在的物种数。ACE指数越大，表明群落的丰富度越高。

Shannon： （Shannon, 1948a, b）综合考虑了群落的丰富度和均匀度。Shannon指数值越高，表明群落的多样性越高。

Simpson： 用来估算样好握品中微生物的多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低。辛普森多样性指数=1-随机取样的两个个体属于不同种的概率。

alpha多样性指数具体描述如下：

计算菌群丰度（Community richness）的指数有:

Chao  - the Chao1 estimator ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.diversity.alpha.chao1 );

ACE  - the ACE estimator ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.ace.html#skbio.diversity.alpha.ace );

计算菌群多样性（Community diversity）的指数有:

Shannon  - the Shannon index ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon );

Simpson  - the Simpson index ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.simpson.html#skbio.diversity.alpha.simpson );

测序深度指数有:

Coverage - the Good’s coverage ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.goods_coverage.html#skbio.diversity.alpha.goods_coverage )

alpha多样性与丰度展示稀释曲线

微生物多样性分析中需要验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，稀释曲线（丰富度曲线）可以用来检验这一指标，并间接反映样品中物种的丰富程度。具体方法为:利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，来计算抽取n个（n小于测得reads序列总数）reads时出现OTU数量的期望值，然后根据一组n值（一般为一组小于总序列数的等差数列）与其相对应的OTU数量的期望值做出曲线来。当曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种；反之，则表示样品中物种多样性较高，还存在较多未被测序检测到的物种。

注：横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表观测到的OTU数量。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。Shannon-Winner曲线

Shannon-Wiener 曲线，是利用shannon指数来进行绘制的，反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。 当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。其中曲线的最高点也就是该样本的Shannon指数，指数越高表明样品的物种多样性越高。

注：与上图一样，横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表的是反映物种多样性的Shannon指数。Rank-Abundance曲线

Rank-Abundance曲线用于同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。

注：横坐标代表物种排序的数量；纵坐标代表观测到的相对丰度。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量，如果曲线越平滑下降表明样本的物种多样性越高，而曲线快速陡然下降表明样本中的优势菌群所占比例很高，多样性较低。

这部分内容就讲到这里，后期我们会介绍微生物多样性beta多样性分析，研究微生物的同学请保持关注哦。

更多可观看《 微生物多样性分析原理视频课程 》

参考文献

[1] Shannon, C.E. (1948a). A mathematical theory of communication. The Bell System Technical Journal 27, 379-423.

[2] Shannon, C.E. (1948b). A mathematical theory of communication. The Bell System Technical Journal 27, 623-656.

[3] Simpson, E.H. (1949). Measurement of Diversity. Nature 163, 688.

[4] Chao, A., and Yang, M.C.K. (1993). Stopping rules and estimation for recapture debugging with unequal failure rates. Biometrika 80, 193-201.

[5] Chao, A. (1984). Nonparametric Estimation of the Number of Classes in a Population. Scandinavian Journal of Statistics 11, 265-270.

更多生物信息课程：

1. 文章越来越难发？是你没发现新思路，基因家族分析发2-4分文章简单快速，学习链接： 基因家族分析实操课程 、 基因家族文献思路解读

2. 转录组数据理解不深入？图表看不懂？点击链接学习深入解读数据结果文件，学习链接： 转录组（有参）结果解读 ； 转录组（无参）结果解读

3. 转录组数据深入挖掘技能-WGCNA，提升你的文章档次，学习链接： WGCNA-加权基因共表达网络分析

4. 转录组数据怎么挖掘？学习链接： 转录组标准分析后的数据挖掘 、 转录组文献解读

5.  微生物16S/ITS/18S分析原理及结果解读 、 OTU网络图绘制 、 cytoscape与网络图绘制课程

6. 生物信息入门到精通必修基础课，学习链接： linux系统使用 、 perl入门到精通 、 perl语言高级 、 R语言画图

7. 医学相关数据挖掘课程，不用做实验也能发文章，学习链接： TCGA-差异基因分析 、 GEO芯片数据挖掘 、 GSEA富集分析课程 、 TCGA临床数据生存分析 、 TCGA-转录因子分析 、 TCGA-ceRNA调控网络分析

8.其他课程链接： 二代测序转录组数据自主分析 、 NCBI数据上传 、 二代测序数据解读 。

⑦ 怎么分析微生物群落结构和多样性

微生物群落的种群多样性一直是微生物生态学和环境学科研究的重点。近几年来，微生物群落结构成为研究的热点。首先，群落结构决定了生态功能的特性和强弱。其次，群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。再次，群落结构变化是标记环境变化的重要方面。因此，通过对目标环境微生物群落的种群结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。
从年代上来看，微生物群落结构和多样性解析技术的发展可以分为三个阶段。20世纪70年代以前主要依赖传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，对环境微生物群落结构及多样性的认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人员通过对微生物化学成分的分析总结出了一些规律性的结论，从而建立了一些微生物分类和定量的方法即生物标记物方法，对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代，现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。
1 传统培养分离方法
传统培养分离方法是最早的认识微生物群落结构和多样性的方法，自1880年发明以来一直到
现在仍被广泛使用。传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少(仅占环境微生物总数的0.1%～10%[1])。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测种群结构的动态变化。
2 群落水平生理学指纹方法(CLPP)
通常认为微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。酶分子对于所催化的生化反应特异性很高，不同的酶参与不同的生化反应。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一，标记了某种群的存在。由Garlan和Mills[2]于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)是通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性分析方法。具体而言，CLPP分析方法就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源基质的利用能力，来确定那些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。由BIOLOG公司开发的BIOLOG氧化还原技术，使得CLPP方法快速方便。商业供应的BIOLOG微平板分两种：GN和MT，二者都含有96个微井，每一
128 生态环境 第14卷第1期（2005年1月）

微井平板的干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑[3]。其中，BIOLOG的GN微平板含有95种不同碳源和一个无碳源的对照井，而MT微平板只含有培养基和氧化还原染料，允许自由地检测不同的碳源基质[3]。检测的方法是：将处理的微生物样品加入每一个微井中，在一定的温度下温育一定的时间(一般为12 h)，在温育过程中，氧化还原染料被呼吸路径产生的NADH还原，颜色变化的速率取决于呼吸速率，最终检测一定波长下的吸光率进行能源碳的利用种类及其利用程度的分析[4]。
BIOLOG方法能够有效地评价土壤和其它环境区系的微生物群落结构[3~6]。其优点是操作相对简单快速，而且少数碳源即能区别碳素利用模式的差别[5]。然而，BIOLOG体系仅能鉴定快速生长的微生物，而且，测试盘内近中性的缓冲体系、高浓度的碳源及有生物毒性的指示剂红四氮唑(TTC)使得测试结果的误差进一步增大。姚槐应[5]的研究表明，应根据测试对象的特点（例如pH，碳源利用类型及利用能力）改进BIOLOG体系，并且，有必要研究更好的指示剂来取代TTC。
3 生物标记物方法
生物标记物(Biomakers)通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。由于特定结构的标记物标志着特定类型的微生物，因此一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。由于分类的依据是从混合微生物群落中提取的生化组成成分，潜在地包括所有的物种，因而具有一定的客观性。并且分析简便快速，适于定性甚至半定量地检测微生物体系的动态变化。20世纪80年代以来常用于研究微生物群落结构的生物标记物方法包括：醌指纹法(Quinones Profiling)、脂肪酸谱图法(PLFAs和WCFA-FAMEs)。测定时，首先使用合适的提取剂提取环境微生物样品中的这些化合物并加以纯化，然后用合适的溶剂制成合适的样品用GC或LC检测，最后用统计方法对得到的生物标记物谱图进行定性定量分析。
3.1 醌指纹法(Quinones Profiling)
呼吸醌广泛存在于微生物的细胞膜中，是细胞膜的组成成分，在电子传递链中起重要作用[7]。醌的含量与土壤和活性污泥的生物量呈良好的线性关系的研究表明，醌含量可用作微生物量的标记[8]。有两类主要的呼吸醌：泛醌(ubiquinone, UQ)即辅酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即维生素K[9]。醌可以按分子结构在类(UQ和MK)的基础上依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的
氢原子数进一步区分。研究表明，每一种微生物都含有一种占优势的醌[7]，而且，不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌[9]。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。
用醌指纹法描述微生物群落的参数[7]有：(1)醌的类型和不同类型的醌的数目；(2)占优势的醌及其摩尔分数含量；(3)总的泛醌和总的甲基萘醌的摩尔分数之比；(4)醌的多样性和均匀性；(5)醌的总量等。对两个不同的群落，由上述分析所得数据可以计算出另一个参数____非相似性指数(D)，用于定量比较两个群落结构的差异。
醌指纹法具有简单快速的特点，近几年来广泛用于各种环境微生物样品(如土壤，活性污泥和其它水生环境群落)的分析。
考察了醌指纹法分析活性污泥群落的分析精度，证明此方法是一种可靠的分析方法。然而，醌指纹法也存在一定的局限性，它不能反映具体哪个属或哪个种的变化。 3.2 脂肪酸谱图法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)
从微生物细胞提取的脂肪类生化组分是重要的生物量标记物，例如，极脂(磷脂)、中性脂类(甘油二酯)可分别作为活性和非活性生物量的标记物[10]。更重要的是，提取脂类的分解产物____具有不同分子结构的混合的长链脂肪酸，隐含了微生物的类型信息，其组成模式可作为种群组成的标记。多种脂肪酸谱图法广泛用于土壤、堆肥和水环境微生物群落结构的分型和动态监测[11~13]。
常用的脂肪酸谱图法可分为两种：磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法和全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法[14]。二者分析的对象实质上都是脂肪酸甲酯，不同之处在于提取脂肪酸的来源不同。磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法提取的脂肪酸主要来源于微生物细胞膜磷脂即来源于活细胞，全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法提取的脂肪酸来源于环境微生物样品中的所有可甲基化的脂类即来源于所有的细胞（包括活细胞和死细胞）。因此，磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图法的优点在于准确，可靠；全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)谱图法的优点在于提取简捷，所需样品量少。对多个环境微生物样品分析而言，先用WCFA-FAMEs谱图法预先筛选再用PLFAs法进行分析是提高效率的较佳选择。
脂肪酸谱图分析包括两种形式：一种是脂肪酸，采用GC分析仪达到分离不同结构的分子的目的；另一种是脂肪酸甲基化产物____脂肪酸甲酯，采用GC-MS分析仪进行不同分子的分离和鉴定。

⑧ 微生物多样性qiime2分析流程(9) 数据可视化分析(中）之绘制相关性热图

前面介绍了微生物多样性如何整合数据并进行了基础可视化分析，现在让我们开始进行更加深入的相关性分析和差异分析（相关性热图，RDA，CCA，Lefse）

一般我们主要绘制属水平物种与理化因子的相关性热图

依然信誉使用我们转化为 phyloseq 的对象的数据集，首先让我们导出属水平物种组成表：

导出数据之后我们要对属水平物种组成表进行过滤，把丰度占比低于1%的归入others类
让行坦链我们自定义一个函数对其进行过滤

经过上面的步骤我们完成了对数据的过滤，接下来让我们用属水平的物种组成表结合理化因子数据绘制档孙相关性热图：

经过上面两步我们完成了相关性热图的分析及可视化，接下来进行RDA，CCA的分析

⑨ 微生物多样研究—β多样性分析概述

一、β-多样性分析介绍

1.  β（Beta）Diversity：

是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。

β多样性分析前的数据“来源”：

    1）OTUs的丰度信息表；

    2）OTUs之间的系统发生关系，

    计算UnweightedUnifrac及Weighted Unifrac距离。

通过多变量统计学方法主成分分析(PCA， Principal Component Analysis)，主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加权组平均聚类分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method withArithmetic Means)等分析方法，从中发现不同样品（组）间的差异。

2. PCA & PCoA分析

主成分分析（PCA）是多变量统计学中最为人熟知的分析方法，它通过线性变换，将原始的高维数据投影至少量新合成的变量（即主成分），从而简化数据结构，展现样品的自然分布。

主成分分析不考虑原始变量之间可能存在的相互关系，并且是基于欧式距离评价样品之间的相似度。

多维尺度分析与主成分分析类似，但是它可以采用任何距离评价样品之间的相似度。主坐标分析（Principalcoordinates analysis，PCoA）是经典的多维尺度分析方法。

3.  UniFrac距离

由于微生物极其多样，不同微生物彼此之间的系统发育关系往往千差万别，仅仅将群落中不同微生物成员视为相互独立的变量显然并不合理。  

因此，在比较不同群落样品之间的差异时，需要考虑两个群落成员之间的系统发育关系是否相似。 

基于这个思想，计算微生物群落样品间距离的UniFrac距离应运而生，通过比较两个群落各自独有的微生物成员之间系统发育关系的远近，更为客观地反映两个群落样品之间的相似程度

UniFrac距离有：

1）非加权（Unweighted）

仅仅考虑微生物成员在群落中存在与否，而不考虑其丰度高低。

2）加权（Weighted）

兼顾群落成员之间的系统发育关系以及它们在各自群落中的丰度高低。

两种距离算法侧重于不同的群落结构特征：究竟是由于群落成员的截然不同导致样品的差异，还是由于同一组成员在不同样品中丰度梯度的改变导致样品的差异。 

由于主坐标分析是以“无监督”的方式降维分解样品距离矩阵，因此，合理运用非加权和加权两种UniFrac距离，可以较全面地揭示微生物群落数据背后隐含的生态学意义（即UniFrac PCoA分析）。

4.  聚类分析

聚类分析：通过等级树的形式展示样品间的差异大小。

※ 与多维尺度分析相同，聚类分析可以采用任何距离评价样品之间的相似度。

常用的聚类分析方法包括：

1)非加权组平均法（Unweightedpair-group method with arithmetic means，UPGMA） 

2)单一连接法（Single-linkageclustering）

3)完全连接法（Complete-linkageclustering）

4)……等。

⑩ 怎样才能改善人体肠道微生物群落多样性

人体肠道中庞大而复杂的微生物群落对人体自身代谢表型有深远的影响。肠道微生物群落在亚种或菌株水平上表现出极大的多样性。利用微生物分子生态学、元基因组学和代谢组学研究方法,发现肠道微生物与宿主表现出共进化的特点,肠道微生物群落及其基因组为宿主提供了互补的遗传和代谢功能,表现出互惠共生关系。但孝余轿是,肠道微生物群落中影毁败响宿主代谢表型的关键功能菌鉴定及其作用模式问题仍然悬而巧肆未决,综合运用多种高通量研究方法和多维数据分析方法可能成为解决这个问题的突破口。