最新研究基因分型的方法

Ⅰ sbt做hla基因分型分析怎么做

sbt做hla基因分型分析怎么做
HLA系统研究从70年代到80年代末期主要是血清学研团灶究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代的塌戚扮血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异仔闭性。1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，随着测序技术的突飞猛进，基于DNA序列的分型方法已经取代了传统的血清学及细胞学分型方法。现DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。其中PCR-SBT测序方法是现世界卫生组织（WHO）推荐的HLA分型方法的“金标准”。

Ⅱ 什么叫基因分型，基因分型的方法有哪些

基因分型（Genotyping）是利用生物学检测方法测定个体基因型（Genotype）的技术。又称为基因型分析（Genotypic assay），使用技术包括聚合酶链反应（PCR）、DNA片段分析、寡核苷酸探针（ASO probes）、基因测序、核酸杂交、基因芯片技术等。

方法：
一些常用的基因分型技术有：限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）、末端限制性长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, t-RFLP）、扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphisms, AFLP）、多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）等。

临床应用：
DNA片段分析能够诊断疾病导致的遗传变异，如微卫星序列不稳定（Microsatellite Instability, MSI）、三体型（Trisomy）、非整倍体（Aneuploidy）、杂合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）等。微卫星序列不稳定和杂合性缺失与结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌的肿瘤细胞基因型有关。第21号染色体的三体型是种常见的非整倍体，临床表现为先天愚型（Down Syndrome）。

Ⅲ 基因分型就是把相同的分在一起吗

基因分型（genotyping），或称为基因型分析在群体遗传学（如不同人种的特征）和法医学（如亲子鉴定）方面有广泛的应用，早期利用Southernblots进行基因分析，但是这种方法耗时长，操作繁琐，让许多研究人员偿尽了苦头。随着定量PCR的出现，相关技术的革新，PCR已使这些基因组学和转录组学发生了翻天覆地的变化，甚至随着免疫PCR的普及开始进军蛋白组学。相关技术要点1．实验设计必需保证野生型的被限制性内切酶切开。因为对于只有少量突变型的SNP位点，如果突变型被切开，那么所得到的实验结果就是大量没有被酶切开的PCR产物，而这个结果与酶切实验失败的结果非常类似，不易区分，对结果的判读造成很大的麻烦，因此保证了主频碱基被解开，从根本上保证了实验的可靠性。2．偏向性扩增的解决。所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。为此，本公司专门设计一个方案，用以克服偏向性扩增。3．方案设计中的内切酶的选择虽然从理论上，我们的方案可以进行任意位点改造，但事实上在改造过程中会出现一系列的问题，包括扩增效率，碱基划移等一系列问题，使得改造方案失败。对此，我们公司专业开发了一个引物设计软件，通过运算获得最佳的改造方案，同时通过在正向和反向序列上同时设计方案，以保证试验的成功。

Ⅳ 人类白细胞抗原（HLA）基因分型

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC），又称主要组织相容性复合基因，是存在于大部分脊椎动物基因组中的一个基因家族，与免疫系统密切相关。MHC有两个类型，第一类MHC（I型）处理细胞内部被分解后的蛋白质（例如病毒的），其分布最广，存在于体内所有有核细胞表面。而第二类MHC（II型）主要在某些免疫细胞表面表达，其功能在于当外部入侵者经过胞吞并利用溶酶体处理后形成碎片，MHC与这些碎片结合，并呈现在细胞表面上供T细胞所辨识（呈递抗原）。

其中人类的MHC糖蛋白，又称为人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，简称 HLA ），与人类的免疫系统功能密切相关。其位于6号染色体的短臂上（6p21.31），包括一系列紧密连锁的基因座，部分基因编码细胞表面抗原，成为每个人的细胞不可混淆的“特征”，是免疫系统区分自身和异体物质的基础。HLA基尺散因高度多态化，存在许多不同的等位基因，因此能够细致调控后天免疫系统。此外，在进行移植手术时人类白细胞抗原决定组织相容性。捐献者和接受者的人类白细胞抗原越相似，排异反应就越小。只有同卵双胞胎的人类白细胞抗原是完全一样的。

HLA根据不同的基因位点分为三大类型：I型，II型和III型

基于HLA基因座的高度多态性，且由于目前有众多的研究在深入了解HLA类型和疾病之间的关系，因此HLA分型在免疫学分析中是不可或缺的。在了解HLA基因分型之前让我们先看看HLA等位基因的命名方式。

HLA等位基因命名方法

HLA基因分型
HLA分好姿型的方法主要有血清分型和DNA分型

随着二代测序技术的发展，对高通量测序数据的挖掘显得越来越重要，如何从海量的测序数据中识别出HLA序列从而对其进行分型呢？近年来有许多研究者开发了基于二代测序数据的HLA基因分型方法，这些方法各有各的优势以及侧重点。

基于全外显子组测序（WES）或全基因组测序（WGS）的HLA分型算法及工具

基于转录组测序（RNA-seq）的HLA分型算法及工具

以及其他一些工具还待收集 ^ _ ^，下次再讲讲如友困绝何具体使用这些工具

Ⅳ HLA分型技术的研究

纵观HLA系统的研究过程，其发展无不与技术的手段的突破与运用有密切关系。70年代到80年代末期主要是血清学研究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段，进展尤为显着。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代并不断完善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。
血清学分型借助的是微量淋巴细胞毒试验（microlymphocytotoxicitytest）或称补体依赖的细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入兔补体，充分作用后加入染料，，着染的细胞为死亡细胞，依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理，待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。血清学分型存在诸多缺点：①标准分型抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应，②缺少某些单价抗血清；③某些病理过程可能导致外周血淋巴细胞表面抗原性质发生改变．干扰抗原—抗体反应；④国内供HLA—I类抗原分型的血清板来源困难、质量欠佳。上述因素均严重影响了HLA分型结果的可靠性及该技术的推广应用。
细胞学分型技术指的是通过纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC）及预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）对HLA分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型技术下正逐渐淘汰。
1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，这类方法近年来在研究和应用方面发展非常快，有取代其他方法的趋势。DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的搭野方法。下面简要的阐述各方法的原理和优缺点。
基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。
PCR-RFLP：其原理是将目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以其简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区知仔喊分有限的多态性。
PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）：也称PCR-ASO（allele specific oligonuceotide）。用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片断产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品要进行多次杂交（甚至十几次）才能完成定型分析操作也十分繁琐。于是在此基础上又发展起来一种反向杂交法（reverse hybridization）。将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物（待检测基因DNA）反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因分析。此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一（如温度，离子戚差强度）, 易出现误差;不能检测新等位基因，试剂盒需不断升级; 对某些杂合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01#113）。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存（三种效果比较）。
PCR-SSP：上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最终均需用标记的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物（sequence specific primer,SSP），借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行, 分辨率可从低到高, 成本低 。缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成象仪保留原始资料，增加实验成本（三种效果比较）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂（引物）,且不能识别非经典的HLA基因和假基因（绿）。针对HLA外显子和内含子序列精心设计引物可避免这些问题。
PCR-SBT: 以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。但是由于杂合子的存在，无法分辨单元型。
以上各个方法都存在无法克服的缺陷，如能配合使用，则能大大提高分型能力。国外有学者对60个样本进行研究，发现单用SBT，只有18%的样本能将A，B位点同时分型成功，如结合SSO，则能将所有样本成功分型。
基于核酸序列识别的分型方法始终无法越过杂合子的难关。HSE(Haplotype-specific extention)技术完美地解决了这一问题。它是利用磁珠与其中一条同源染色体的特异位点结合，达到分离同源染色体的目的，杂合子问题不攻自破。因此，HSE无论与SSO还是SBT结合使用，都有极好的效果（1.01#12，4.01#94）。
近年来，测序新技术发展层出不穷，纷纷运用到HLA分型中。如MSNE(multiplex single nucleaotide extention),应用链中止法原理，根据等位基因SNP位点设计特异性引物和生物素荧光标记的ddNTP进行分型，有重复性好，可分辨杂合子等优点，已应用到A位点的分型中。（4.01#93）又如pyrosequencing 法分型，分辨率好，可分辨杂合子，自动化程度也高。DNA芯片技术，作为一项检测SNP的成熟技术，也已应用到HLA 分型中.
基于序列分子构型的分型方法在理论上就避开了杂合子这个难题。SSCP(PCR单链构象多态性分析，PCR-single strand conformational polymorphism)是最常用的根据构型的分型方法。扩增的目标产物变形后形成单链，不同的序列，甚至仅有一个碱基的差异，就会形成不同的茎环结构，从而电泳速率不同。但此方法仅限于分辨仅限于200－300bp（绿16），且即使是同一单链DNA在相同情况下也会形成不同的构型，使得电泳条带很难分析;也有可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小的情况,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
HA(异源二聚体电泳多态性，Heteroplex Analysis)是另一种基于序列分子构型的分型方法，根据异源二聚体未配对区域的长度和分布而显示出电泳条带不同（绿18）。但与单链DNA相比，异源二聚体电泳条带过于复杂，难以分析。
新发展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技术根据HA的原理，设计了位点特异性荧光标记的参照DNA片段，与样本DNA分子的正反链形成异源二聚体.带有荧光标记的电泳条带易于分析，能够克服HA的不足。
另外，提取基因组模板的技术也在不断发展。用于分型的DNA来源也已不局限于血液，口腔涂片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01#261）。针对微量基因组模板的情况，现已开发出基于滚环复制的全基因组扩增技术，可以将1ng的模板扩大至100ng，足以应付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技术的要求。

Ⅵ 什么叫基因分型，基因分型的方法有哪些

我说TaqMan-MGB探针合普通PCR

Ⅶ 基因分型DLBCL

    DLBCL根据基因数据做分型的问题。文章前期对574例DLBCL活检样本进行多平台基因组分析，确定了ABC和GCB病例中发生频率显着不同（P<0.05）的基因。通过一些GCB分型和基因（NOTCH1，NOTCH2，BCL6，SPEN）之间关系的结果，表明基因表达亚群可能有不同遗传亚型。通过Genclass和随机森林模型对基因数据做分型。    

     文中给出了分型方法根据MYD88（L265P），CD79B，BCL6，NOTCH2，NOTCH1，EZH2，BCL2基因状态判断分型。见图1。后边附加了算法，个人初步看了一下认为是分型模型算法的过程，碰到这个机会解剖学习一下。

    第一部分，详细介绍了mutation，Subclonal Mutation,Truncation,Subclonal Truncation,Focal Amplifictions,Focal Homozygous Deletions,Focal Losses纳入分析的标准，也是纳入分析的数据的指标筛选介绍。筛选最后剩余五个特征，a） MYD88L265P突变，b） 非L265P的MYD88突变，c） BCL6融合，d） BCL2易位，e） CD274（PD-L1）或PDCD1LG2（PD-L2）融合。同时删除了少于四个样本中发现的特征，组合特征要求因突变而包含在特征中的样本数量至少与因拷贝数而包含的样本数相同，而且因拷贝数而包含的样本至少为4个。

    第二部分 GenClass迭代遗传子类型算法，对遗传算法不是很懂，下边看得有点茫然，要多查查资料啊~从初始seed分类开始，并以这样一种方式进化它，使其与我们特征集最大化，同时依然保持初始分类所建议的生物学特征。 

 算法遵循的要点：

    1.从初始seed开始，2确定与当前分类关联度最高的功能列表，3基于这些特征，计算当前分类和所有分类的关联统计信息与之不同的替代分类法最多只改变一个样本，并确定预测得分最高的分类，4a）如果步骤3中确定的最佳分类不是当前分类，则使用最佳分类替代当前分类，返回步骤2,4b)如果步骤3中确定的最佳分类是当前分类，则停止迭代并将其最为最终结果报告。

详细步骤：

step1初始样本分类

    1.那些带有NOTCH1突变的样本最初被归类为N1，2.对同时存在MYD88（L265P）突变和CD79B突变的样本作为MCD，3.有NOTCH2突变或BCL6融合的样本最初被归类为BN2,4.有EZH2突变（克隆，亚克隆）或者BCL2易位的样本最初被归类为EZB，5.所有其他样本最初被归类为其它样本。 （这边有些不懂，之前认为第一部分筛选出来的基因是用于分类的，但是这步突然冒出来NOTCH1，CD79B，NOTCH2，EZH2，前后无关联）

step2识别与当前分类相关的特征

    给定样本S和特征值F，定义S，F之前关联的意义，通过贝叶斯连续校正的卡方统计量

公式中的N是总样本数，IS和IF是样本集S或者具有特征F的指标，在F样本集上求和。

分类和特征之间的关联等于最大值

根据这些统计数据，与当前分类关联的特征列表被定义为满足下来条件的所有特征：1.根据目前分类法，至少有一个特征F患病率10%；2.不存在其他F’与F对应的基因相关。如果有两个或者更多的特征与相同基因同是最高的得分，随机选择一个。3.如果F是一个拷贝数或者组合特征，则没有其他拷贝数或者组合特征F，使得V（洞镇F’）>V(F)与F’相关基因和与F相关基因距离在15MB之间，如果15MB之内得分都昌颤衡是最高，则随机选择其中一个特征，其余被排除。4.V（C，F）>10.85即P<0.001。

step3计算当前分类和替代分类的关联统计

    每次最多改变一个class label，计算Ω（Ccurrent），通过公式：耐做

    计算最佳得分。对step2中表示的当前分类下的所有特征取和。如果多个分类是最佳的，则随机选择一个。

step4 停止程序或者继续下一个迭代

    如果最佳值不是当前值，则样本重新分类。我们使用最佳值作为当前分类，重新step2。如果当前是最佳分类，则停止。理论上来说迭代可能陷入循环不收敛，为了防止扩展了停止条件，一般在以前的任何迭代中best曾经被用作current则停止。

随机森林模型的建立

        之后又通过随机森林建立了模型，和GenClass相同，建立4个种子子集和一个其他集合。1.那些带有NOTCH1突变的样本最初被归类为N1，2.对同时存在MYD88（L265P）突变和CD79B突变的样本作为MCD，3.有NOTCH2突变或BCL6融合的样本最初被归类为BN2,4.有EZH2突变（克隆，亚克隆）或者BCL2易位的样本最初被归类为EZB，5.所有其他样本最初被归类为其它样本。

两种分类模型给出的结果重合度比较高

 项目有时限，具体算法没有实际操作，所以理解可能不足，不过也算是有一点点认识了。翻译和理解有问题的地方，欢迎留言~

Ⅷ 基因型分型的方法

基于分子杂交→基于DNA扩增→基于DNA测序

将DNA转移到硝酸纤维素膜上，利用DNA-DNA杂交检测特定DNA片段的方法。

通过设计不同的备埋指DNA探针可实现不同等位基因类型的区分。
探针设计是Southern Blot最为重要的环节之一。

又称DNA chip/DNA微矩阵（DNA microarray）
将一系列已知序列的DNA探针分子以高密度固定于支持物上，通过与标记的DNA样品分子进行杂交实现仿配DNA的序列分析。

优点：高通量、大规模、平行液塌化、集约化。
缺点：非特异性高。

以上内容参考中国大学MOOC网站复旦大学遗传学。