致突变的研究方法

❶ 埃姆斯实验的介绍

Ames试验全称污染物致突变性检测。艾姆斯(ames)试验是由美国加州大学生物悄困化学家穗谨艾姆斯等人经多年研究创建的一种用于检测环境中致突变物的测试方法，是利用经人启族念工诱变了的微生物作为指示微生物的一监测方法。这种方法实际是检测化学物质的致突变作用1。

❷ 化学物致癌作用的研究方法有哪些

国际环境致突变物致癌物防护委员会（icpemc）告蔽1983年提出把致突变试验所反映的遗传学终点分为5类：
dna完整性的陆做改变（形成加合物、断裂、交联）；
dna重排或交换；
dna碱基序列改变；
染色体完整性早友衡改变；
染色体分离改变。
其中第3实际指基因突变，而第4和第5依次指染色体结构改变和数目改变。

❸ 遗传毒性与致突变作用的关系是怎样的

后者属于前者造成的影响之一。具体关系只能啰嗦点儿才能说清楚了...

首先遗传毒性指的是化合物能够作用基烂于细胞的遗传物质，影响其完整性。比如说具有放射性的化学品会作用于DNA。

所以基本上任何能作用于DNA的物质都属于有遗传毒性的物质。比如芳香胺一类的化学品可以通过其亲核性与DNA形成稳固的共价键，从而妨碍复余脊制，而且有些情况下即便没有稳固的共价竖锋渗键也能妨碍遗传信息复制。

而遗传毒性通过影响生物的遗传信息造成的三大影响就是致癌作用、致突变作用及致畸作用。其中致突变作用指DNA异常导致蛋白质合成异常，致癌作用指导致细胞增殖失控，致畸作用指导致母体孕期内胚胎畸形。

❹ 毒理遗传学的致突变、致畸、致癌物质检测

对各唤胡颤种化学物质的致癌和在胚胎发育过程中的致畸效应的检测，早期的方法是用待测化学物质喂饲、注射动物或和败涂布在动物皮肤上，然后观查动物是否因此而患肿瘤或出现畸胎等。这种方法往往要用几种动物并重复做橡试验才能得出可靠的结论，而且费用大，时间长。绝大部分致癌物质具有诱变作用这一发现促使人们考虑用简便的测试方法来代替动物试验。现在一般都采用细菌或离体培养的哺乳动物和人类体细胞为测试对象，主要的方法有：

❺ 化学物质致突变的机理

不同的化学物质致突变、致癌和抑制酶活性的生物化学作用机理是不同的。
以二恶英为例：

二恶英类化学物质的毒性机理

二恶英类化学物质毒性的分子机制还没完全研究清楚，但经过二十多年的研究人们对其机理也有了一定的认识。总的说来二恶英类化学物质产生作用并不是通过直接的损伤，二恶英类化学物质并不与蛋白质和核酸形成加合物，也不直接损害细胞DNA。它们的作用主要是通过芳香烃受体诱导基因表达，改变激酶活性，改变蛋白质功能等而起作用。

通过芳香烃受体介导基因表达（如P4501A1）是二恶英类化学物质毒性作用最主要也是最基本的作用机制。芳香烃受体是一高分子量的蛋白质（110-150KD），与二恶英类化学物质有可逆转的高亲和力，主要存在于细胞浆中（也有小部分在胞核中），其作用模式类似于甾体类受体，但也有不同。该蛋白属于basichelix-loop-helix PAS(Per-Arnt-Stim)超家族，该家族均为转录因子)，均含有两个功能部位即：basichelix-loop-helix部位和PAS功能部位，该族蛋白对激活基因的转录具有重要意义。且各芳香烃受体具有明显的种间，种内和组织差异。芳香烃受体在细胞浆中是以380 KD的复合物无活性的形式存在，除自身外还有3-4种蛋白质与之结合，其中只鉴别出了90 KD的热休克蛋白（heatshock protein, HSP90），该蛋白对受体的活性具有重要影响。
芳香烃受体介导的基因表达基本的作用过程可区分以下几个基本过程：①二恶英类化学物进入细胞；②化合物与芳香烃受体结合；③配体-受体复合物与DNA识别位点结合；④特异基因的转录及翻译；⑤表达蛋白发挥作用。在这些过程中，前三步研究的较清楚，而后续过程还不是很清楚．

❻ 毒理学新技术以及发展方向介绍

毒理学是一门研究化学物质对生物体的毒性反应、严重程度、发生频率和毒性作用机制的科学，也是对毒性作用进行定性和定量评价的科学。毒理学与药理学密切相关，目前已发展成为具有一定基础理论和实验手段的独立学科，并逐渐形成了一些新的毒理学分支。本文就新技术在分子毒理学中的应用及毒理学的一些发展趋势作一简述世困。
1基因引入技术在毒理学中的应用
分子毒理学研究是采用分子生物学技术和方法来研究毒理学问题。如体外采用细胞培养等检测基因毒性，整体动物试验采用转基因动物模型，这对于阐明外源性化学物的毒性及其机制均有重要意义。
基因引入技术是把一段DNA（可以是一个完整的基因，也可以是一个基因片段）引入到细胞或生物体内。引入的DNA可以改变毒物的作用强度，或改变毒物作用方式。因此，可以通过毒物作用程度或方式的改变来判断引入的DNA所起的毒性作用。
1.1在致突变检测中的应用
基因毒物是指能损害遗传物质DNA的化学物，大多为致突变剂。常规的Ame′s试验是由细菌介导的检测考试，大网站基因毒物的方法。但这种方法也有一定的局限性，有时可出现假阳性结果。如谷胱甘肽和半胱氨酸均为抗癌剂，但在Ame′s试验中却显示较强的致突变能力。此外，细菌和动物细胞在其生物学方面有很大差异，因此体外动物细胞实验较细菌更能反映毒物在机体内的作用。有两类细胞常用于基因毒物的检测，一类为原代细胞，另一类为传代细胞。有多种指标用于检测化笑返裤学物的基因毒性，如核苷酸同位素标记法，若一种化学物能损害DNA，细胞在用该化学物处理后，对损害的DNA要进行修复，修复过程需要核苷酸，如果在培养基中加入同位素标记的核苷酸，则修复的DNA即被同位素标记，在一定情况下，损害的DNA越多，修复的就越多，细胞DNA含的同位素就越多。碰简因此，通过检测DNA中同位素的含量来决定该化学物的基因毒性。另一种判断方法是根据基因毒物能改变细胞的代谢。如正常的V79细胞具有次黄嘌呤磷酸转移酶，这种酶是正常替代途径中合成嘌呤核苷酸的必需酶。如果培养基中有嘌呤的同系物（如8-偶氮鸟嘌呤），这种酶能将其同系物转化成相应的嘌呤核苷酸而合成DNA，但嘌呤同系物没有正常嘌呤功能，因此会导致细胞死亡。相反，如果一种化学物能损害DNA而使次黄嘌呤磷酸转移酶的基因发生损害而不能合成正常的酶，其受损的细胞反而存活下来。存活的细胞越多，在一定情况下说明该化学物的致突变能力越强。
某些化学物本身并没有毒性，但其代谢物显示出较强的毒性作用。对于这些化学物，上述方法不能检测出它们的毒性。为了克服这一缺点，可在细胞或细菌培养液中加入肝细胞抽提液以帮助代谢毒物。有的实验室还用少量原代细胞与被检的传代细胞混合培养，由引入的原代细胞提供代谢酶。如硝基二甲基胺，用常规的细菌检测系统显示不出任何突变作用，但在细菌培养液中加入肝细胞抽提液后，显示出很强的基因毒性。这些实验也存在许多问题，如有些代谢物的半衰期很短，来不及进入检测细胞与其DNA作用就失活了，肝脏抽提液或原代细胞代谢酶活性随时间下降得很快；肝脏抽提液或原代细胞含多种酶，即使能代谢毒物并显示出毒性，也不知道是哪种酶起主导作用。很显然，建立一种细胞株，能合成某种单一的酶，对研究毒物的毒性作用很重要。利用分子生物学技术，把转录某种代谢酶的DNA连接，再接到基因载体上（多为质粒或病毒），这段具有调控能力的DNA，能与体外培养细胞的转录因子作用，把含有编码某种代谢酶的DNA的基因载体引入到体外培养细胞，该细胞就能表达这种特异的酶。这方面较突出的例子是细胞多功能性单胺氧化酶（P450）。体外建立能表达P450的细胞株有两类，一类是能长期稳定表达的细胞株，一类是能短期表达的细胞株。人的多种P450，如1A1，2A6，2E1，3A4等，已成功地引入人的淋巴样细胞株、鼠的胎盘细胞株、苍鼠肝癌细胞株等，这些细胞株由于能表达毒物代谢酶，对需要代谢后才有毒性的化学物，其检测敏感度提高许多倍。如表达2A6的细胞比不表达2A6的同样细胞株，在检测硝基二甲基胺的毒性方面要敏感500倍；比表达2E1的细胞也要敏感大约500倍。说明硝基二甲基胺要代谢以后才能显示毒性，也说明2A6是能将硝基二甲基胺转化为毒性代谢物的代谢酶，而2E1则不是。
1.2转基因动物在毒理学中的应用
转基因动物是在其基因组中含有外来遗传物质的动物，它被广泛应用于科学研究的各个方面。由于转基因动物集整体、细胞和分子水平于一体，更能体现生命整体研究的效果，因此成为毒理学研究的热点之一。
1.2.1一般毒性研究模型
C-fos-LacZ转基因小鼠用于神经毒性的研究。金属硫蛋白（MT）基因的转基因和基因删除小鼠用于金属和某些非金属的研究。如用MT转基因小鼠对镉等的抗性增加，而MT的基因删除小鼠对镉、银、汞、顺铂和四氯化碳的毒性敏感性增强。
1.2.2致突变检测模型
转基因动物为解决遗传毒性研究中长期存在的一些问题提供了可能性。如体外试验和体内整体动物的定性、定量外推，整体动物基因突变需消耗大量动物和时间，如确定靶器官以及对诱发的遗传改变做精细分析等。自Gosen等1989年建立了第一个转基因突变检测模型以来，已有十多种模型。
1.2.3致癌检测模型及其在致癌物质作用机制研究中的应用
转基因动物为快速检测致癌物、促癌物和研究化学致癌的机制提供了新的重要途径。目前已建立的检测模型或研究模型有：①过量表达癌基因的转基因动物模型如TG，AC小鼠，HK-fos转基因小鼠，ras-H2转基因小鼠，携带激活的H-ras原癌基因小鼠等。这些转基因动物对化学致癌剂的敏感性提高了许多倍。如带有激活Pim-l肿瘤基因的转基因动物，对乙基硝基脲的致癌作用，较相应的非转基因动物，其敏感性提高了25倍；②基因删除动物致癌检测模型用同源重组的方法，将一段DNA整合到抗肿瘤基因，使该抗肿瘤基因不能表达具有正常功能的蛋白质，用这种方法培养的动物称基因删除动物。在这方面研究得最多的是肿瘤抑制基因P53.基因删除动物P53（+/-）和正常动物P53（+/+）一样，发育和生长均无异常，但用致癌剂（如二硝基二甲胺）处理后，P53（+/-）基因删除动物的平均寿命为29周，而P53（+/+）的平均寿命为42周，其肿瘤的发生与分布也有很大的差异。其他如芳香烃受体（AHR）小鼠、过氧化物酶体增殖剂诱导的受体α（PPARα）小鼠等；③转基因动物用于生殖毒性研究ZP3（编码）透明带硫酸糖蛋白基因删除小鼠、雌激素受体基因或孕酮受体基因删除小鼠、DNA甲基转移酶基因删除小鼠等。
1.2.4用于特定组织毒性研究的转基因动物
典型的例子是用含乳糖操纵子的噬菌体培育一种转基因动物，具有乳糖操纵子的噬菌体在感染某些细菌后，菌落为蓝色。如果含有乳糖操纵子的噬菌体在体内由于受化学物的处理而受到损害， 不能抄录正常的半乳糖苷水解酶，这种噬菌体在体外装配后，其感染细菌的菌落为无色。因此根据蓝色和无色菌落的多少，来判断某些化学物基因毒性的强弱。此外，用质粒作为载体也获成功，从而提高了检测的敏感性，更重要的是，化学物处理后的动物，基因载体可以从不同组织细胞分离出来，因此这种动物能显示化学物的组织细胞特异毒理学作用。
2毒理学预测范畴的新进展
毒理学和流行病学，特别是与分子流行病学相结合应用于危险度的评价。经典方法中对安全系数作了许多附加修正，以提高种属之内与之间推导预测的精确性，但其后果使毒理学家面临来自各种行政规定而缺乏科学依据的一连串修正系数。近年来已提出了新的方法，以尽可能使实际数据而不是人为的假设来确定安全系数。如对致癌物质的评定将使用一种定量的模型，它所重视的是从高剂量到低剂量的推导，而不是从动物到人的种属间的推导。目前最常见的是线性多级LMS模型，它是将耐受量（MTD）的可信限上端延伸到原点，利用该直线的低剂量区域来估计外源性化学物的量效关系曲线或其毒性强度。这种模型使用一个对应于小生物学单位：即分子的剂量值，而不是将零作为剂量轴的原点。
外源性化学物安全性评价的策略新进展还包括用毒性等效性因子或问答式的方法，构效关系的定量分析，以及药效和药代动力学模型来研究复杂化学物。
321世纪毒理学的发展趋势
3.1传统和现代毒理学研究方法相结合将推动毒理学的发展过程
过去毒理学研究主要以整体动物试验和人体观察相结合，在相当一段时期内这仍然是重要和必要的手段。随着分子生物学的理论和方法应用于毒理学的研究，将使外源性化学物的毒性评价发展到体外细胞、分子水平的毒性测试与人体志愿者试验相结合的新模式，而传统以动物为基础的毒理学研究将减少。某些复杂的整体实验将逐步为体外试验或构效关系数学模式所代替。目前用于有害因素的毒性试验系统将被基因工程的动物和细胞所代替；传统的发病率和死亡率终点将被生化指标所替代；现在需要数月给药和评价的毒性研究将在几小时内完成。转基因动物对外源性化学物的毒性反应将与人体极为一致，例如取分裂中的人组织培养细胞到体外减数分裂，现行毒性试验的解释和外推方式将改变。
3.2大量新技术和新方法的应用将使毒理学研究水平更加深入
上面提到的一些体外细胞检测和转基因动物或基因删除动物模型应用于毒理学研究外，其他新技术如系列分析法、DNA芯片或DNA微点阵等可同时测定数千个基因的表达，用于观察基因的上调和下调；基因诱捕、代表性差异分析等将为研究化学物致畸的分子机制提供可能；应用基因分布图能区别特异性或非特异性的细胞损伤；应用络合物形成作用介导的PCR研究DNA损伤和核苷酸水平上的修复；生物标记物在毒理学中的应用显得越来越重要，如特异的DNA和蛋白质加合物用于有效暴露的生物标记，用NMR分析尿中的代谢产物，可以确定作为毒性反应生物标记物的代谢变化模式。又如外周血（血小板、白细胞、红细胞）中的生化标记物可用于测定外源性化学物对神经系统损伤的替代标志物。
在毒理学的研究中，重要的问题是如何把从动物所获得的资料用于人，把体外资料用于体内，把复杂的整体系统化为简单的并能人为控制的系统，以及如何提高检测的敏感性等。转基因技术为解决这些问题提供了崭新的手段。在代谢途径上，通过基因转移能人为控制某一化学物的代谢；在整体水平上，可以人为控制某一基因的表达水平，从而阐明该基因在化学物致毒过程中的作用。可以预言，各种不同的转基因动物或基因删除动物的建立，将对阐明化学物的毒性作用机制，起到重大的作用。
3.3采用多种方法结合起来评价化学物的毒性将是一个重要趋势
过去20多年应用常规的毒理学方法研究外源性化学物，对于大多数化学物是否获得足够的毒理学信息值得怀疑。考虑到化学物质的暴露对人类健康的影响，这一问题就显得更为突出。由于毒理学试验要消耗大量动物，因此在毒理学研究中尽量减少动物用量是每一个负责任的毒理学家应该考虑的问题。显然，如果想对如此众多的外源性化学物有一个合理的改变，就应该建立新的、可供选择的、耗费动物少、试验周期较短、花费较少的毒理学研究方法。这些方法应该根据以下标准来衡量：①动物用量减少；②试验周期缩短；③研究化学物在环境中的实际浓度；④利用统计或数学模型；⑤预先进行有效的实验设计；⑥发展管理毒理学等。例如，制药工业将采用啮齿类动物（主要是大鼠）的微核试验与2～4周的毒代动力学研究结合起来的方法来评价药物。
3.4毒理学分支学科形成发展迅速，“二极”分化现象更为突出
近30年来毒理学由于发展迅速及与相关学科的交叉而形成了许多分支。如根据工作任务可分为临床毒理学、环境毒理学、工业毒理学、管理毒理学、生态毒理学与法医毒理学等；根据研究手段与终点不同可分为免疫毒理学、分子毒理学、膜毒理学、遣传毒理学、分析毒理学等；根据研究对象可分为昆虫毒理学、兽医毒理学、人体毒理学与植物毒理学；根据不同外源性化学物可分为金属毒理学、农药毒理学、食品毒理学、放射毒理学、药物毒理学与燃烧毒理学；根据研究工作性质可分为描述毒理学（指常规毒性试验和安全评价）、机理毒理学和管理毒理学等。近年来还出现更多的毒理学分支，如比较毒理学、地理毒理学、急症毒理学等。可以预见，下世纪还将出现一些新的分支。
此外，毒理学分化将更为明显。一方面毒理学的软件部分——管理毒理学仍将是毒理学的研究热点之一，这将从宏观上为化学毒物的管理提供科学依据；另一方面，研究水平越来越精细，从细胞、分子和基因水平研究毒理学问题将是普通的科学工作。上述二方面既分化，又相互渗透和结合，使毒理学的软、硬件结合更为突出。
总之，毒理学与人类日常生活和生产劳动关系日益密切，如环境污染、生态环境的恶化、药物的不良反应、食品的安全性、兽药及农药的危害，以及作业环境的有毒物质是世界范围内的严重问题。可以预见，在21世纪毒理学将会获得更大的发展，为人类作出更大的贡献。虽然近年来细胞、分子水平的研究取得了很大的进展，但仅从基因分子水平研究外源性化学物的毒性及其机制是不够的，因为机体还有宏观的一面，必须把微观研究与宏观研究紧密结合起来，也就是将整体试验与体外细胞、分子水平的研究结合起来才能得出正确结果。

❼ 遗传毒理实验与致突变实验有什么不同

差别在于目的性，致突变实验的目的是验证物质对生漏岩磨物遗传性的改变，遗传毒理实验是验证物质对于生物遗传物质返斗的损害及因此引起的对生物的毒害作用。简单来说，致突变实验研究的是因果，什么物质导致了哪些结果，遗传毒理实验研究的是过程，什么物质怎么导致了那些结果（生物的遗传突变枣清往往对于生物自身是有毒害性的，因此此两种实验无论实验过程还是结果以及记录数据往往很接近或相同）。

❽ 设计一个实验方案，检测某工厂排出的污水是否有致突变作用

（1）酸能使石蕊试液变红色，所以要检验废水仍显酸性，就可以向废水样品中滴加石蕊试液，若溶液变红色，则说明闭迟废水显酸性；（2）酸能和锌粒反应生成氢气，所以我们可以向废水样品中加入锌，如果有气体产生，则说明废水显酸性．欲喊态含在处理污水时采用最经济的方法降低其酸性可以向污水中加入熟石灰．故答案为：（1）取样，滴加紫色石蕊溶液，若变红，证明污水显酸性；（2）取样，加入锌粒，有气郑笑体生成，证明污水显酸性；熟石灰．

❾ 罗望子多糖胶的罗望子多糖胶的毒性和致突变性研究

1996年，赵岩等对罗望子多糖胶的毒性和致突变性进行了研究，发现罗望子多糖胶对雌、雄性大鼠、小鼠经口LD50分别为9260mg/kg和做燃大于纯仔虚10000mg/kg，属于实际无毒。在Ames实验（污染物致突变性的检测）中，未呈现致突变型。在体内试验中，未引起小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率和小鼠精子畸变率的增加，在3项致变试验中，罗望戚谨子多糖胶均未呈现致突变活性。

❿ 遗传毒性试验的实验方法

近十几年,随着遗传毒理学相关领域特别是分子生物学的研究进展,遗传毒性测试评价方法也在不断改进。据报道,目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。根据其检测的遗传学终点可分为4种类型:1检测基因突变;2检测染色体畸变;3检测染色体组畸变;4检测DNA原始损伤。
1现行组合试验方案由于一种遗传毒性检测方法通常只能反映一个或两个遗传学终点。没有一种检测方法能涵盖所有的遗传学终点,故需用一组试验配套进行试验。200多种检测方法中,真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。目前多数国家规定,如体内诱变试验显示1个或以上试验呈阳性结果,则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。
2各类遗传毒性试验方法的研究进展
2.1检测基因突变
遗传毒性试验
2.1.1Ames试验Ames试验是检测化学物质基因突变的常用方法。常规的Ames试验选用四个测试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535测试菌株,该菌株特别适用于检测混合物的致突变性。目前出现的新生菌株具有更高的敏感性和特异性,如YG7014、TG7108,缺乏编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的ogtST基因,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测;引入乙酰转移酶基因的YG1024、YG1029菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。测试代谢活化系统一般采用由Aro-clor1254(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶的S9;国外也有用人肝S9的报道,试验证明其代谢活性明显高于鼠S9[5,6]。为了克服S9制备上的困难和不稳定性,Josephy等将沙门氏菌的芳香胺N-乙酰转移酶基因和人类细胞色素P-450基因Cyp1A2引入细胞,构建了在无外源S9时也可检出芳香胺诱变性的Ames测试菌株如DJ4501A2[7]。
2.1.2TK基因突变试验TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验,近年来其应用价值有明显的提高。TK基因编码胸苷激酶,该酶催化胸苷的磷酸化反应,生成胸苷单磷酸(TMP)。如果存在三氟苷(TFT)等嘧啶类似物,则产生异常的TMP,掺入DNA中导致细胞死亡。如受检物能引起TK基因突变,胸苷激酶则不能合成,而在核苷类似物的存在下能够存活。TK基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等。其基因型均为tk+/-。Honma(本间正充)和张立实(1999)指出原用染毒时间3～6h对于充分检出断裂剂和锤体来说这个时间太短,获阴性结果时应延长至24h。据资料显示对于同一阳性受检物,WTK1细胞的突变频率远高于TK6细胞,认为与WTK1存在p53基因突变有关。Do-brovolsky(1999)建立了tk+/-转基因小鼠,可用于体内试验。
2.1.3转基因小鼠基因突变试验转基因小鼠基因突变试验可在整体状态下检测基因突变,比较不同组织(包括生殖腺)的突变率,确定靶器官,对诱发的遗传改变作精确分析等[8]。1989年Gossen等报道了LacZ转基因小鼠突变测试系统。近年来,国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物,其中3种已投入商品化生产,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的LacZ和/或Lacl作为诱变的靶基因。陈建泉等人(1997)已经以穿梭质粒pESnx载体,以xy1E基因因为诱变靶基因建立了携带xy1E的转基因小鼠,并对转基因小鼠进行了繁殖建系。并已实验证明xy1E转基因小鼠是一个研究体内基因突变的有效模型,它可望成为一种新的转基因小鼠突变检测系统[9]。Heddle等(2000)建立了1个种gptdelta转基因小鼠。HiroyukiHayashi等(2003)将载有E.coligpt基因和λ噬菌体的red/gam基因λEG10DNA整合到SD大鼠每个单倍体基因组q24～q31位点。这种转基因大鼠对乙基亚硝基脲(ENU)和苯并芘(B[a]P)的肝脏毒性显示了很好的敏感性,它也有助于研究遗传毒性物质对小鼠和大鼠的种间差异[10]。
2.1.4反向限制性酶切位点突变分析法(,iRSM)由英国威尔士大学分子遗传和毒理中心建立并完善的[11]。iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变,但这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测,取得了良好的结果:小鼠分别口服N-乙基N-亚硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3天后,以iRSM方法相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的Apa→Ava位点反向突变。结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33%,2-AAF使肝组织突变的发生率为25%,这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突变强度,进一步验证了该方法的高灵敏度和准确性。它具有灵敏度高、快速、操作简便、以及突变检测部位明确等优点,应当说是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段。但是,iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点反向的DNA突变。根据文献资料分析,化合物致突的发生具有一定的规律性,即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。例如,烷化剂和芳香胺类虽易使一连串鸟嘌呤(G)3′端G发生突变[12,13],这可能与该部位电荷密集有关,多数活性氧生成物质的DNA致突作用也具有类似规律[14];CpG二核苷常常是DNA加成物致突变作用部位[15],所以CpG突变的检测在化合物致突检测中具有重要意义,而CpG突变常引发某些固定酶切位点的变化。很显然,iRSM可较广泛地应用于遗传毒性化合物致突作用的检测。
2.2检测染色体和染色体组畸变
2.2.1微核试验传统的体内微核试验仍然是检测化学物质染色体损伤的基本方法。目前微核试验方法主要有以下改进:1体外微核试验常用细胞有中国仓鼠肺细胞(CHL)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及中国仓鼠成纤维细胞(V79)等,近年开始有用L5178Y小鼠淋巴瘤细胞和人的类成淋巴细胞TK6。也有用叙利亚仓鼠胚胎(SHE)细胞和BALB/c3T3细胞。体外试验比体内试验易于操作和控制。缺点是对直接作用的化合物有可能出现假阳性。2周围血微核试验优点是可重复采样,自身对照,减少实验动物数。李尊爱(1999)报道刚断乳不久的小鼠(4～6周龄)用于外周血网织红细胞微核试验比年龄更大的敏感些[16]。3胞质分裂阻滞法微核试验(CB-MNT)很好地排除了细胞分裂的影响。该法中,双核细胞是只分裂了一次的细胞,其结果更加稳定敏感。CB-MNT可观察到多种遗传学终点。观察不同分裂期的细胞比例,计算核分裂指数能检测诱变物对细胞周期的影响。还可检测切除修复,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)位点变异,凋亡。认为该试验可使计数值提高,达到传统方法的两倍或以上。但也偶小于两倍的结果(李来玉,1996)。最近Garriott和Phelps等推荐了关于体外双核细胞微核试验的几个参数条件:细胞松弛素B不影响试验结果;计数2000个双核细胞;长时间暴露没有必要;结果用趋势检验分析;根据相应的细胞毒性选择适当的浓度[17]。
2.2.2染色体畸变试验染色体畸变试验是检测化学物质影响染色体数量和结构的基本方法。在化学物质安全性评价中常选体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验等检测化学物质对染色体的影响。为了准确观察诱发的畸变频数,本试验收获细胞的时间应尽量提前至大多数细胞处于染毒后第1次有丝分裂时(Tucker,1996)。对于染色估数目改变,原则上只适合超倍体的观察。因为涂片时可能人为地把染色体推出细胞外(Tucker,1997),Danford曾建议在制备标本时减弱低渗处理能力,以免涨破细胞膜,从而能准确观察亚二倍体。经研究,认为以0.094mo1/LKC1弱低渗液处理2min～3min是达此目的的最佳条件(楼铁柱,1997)。
2.2.3荧光原位杂交(FISH)技术荧光原位杂交最早由Bauman(1980)建立,后由Lucas(1989)首先应用于染色体畸变分析。其原理是按检测目标准备恰当的DNA序列作为探针,并用生物素标记,对载玻片上待测标本中的DNA杂交,最后通过杂交位点的荧光观察染色体结构或数目的改变。应用特殊染色体和染色体某区域的荧光探针可在体内检测4种类型的细胞遗传学终点[18]。1检测中期细胞染色体畸变。2应用亚染色体区域的探针检测间期染色体断裂和非整倍体。3应用中心粒探针和/或抗着丝点抗体检测微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST间接免疫荧光法,以及小鼠次要和主要卫星DNA探针,在小鼠骨髓细胞证明了受试物引起微核的来源[19]。4哺乳动物精子非整倍体检测。徐德祥(1999)用双色FISH方法对丙烯腈接触男工精子性染色体数目畸变进行了检测,证明FISH技术用于检测精子染色体数目畸变实验结果稳定可靠。
2.3检测DNA原始损伤2.3.1单细胞凝胶电泳技术单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试验(cometassay)。Kizilian(1999)改进了一些试验条件,能明显将细胞调亡和细胞坏死的形象与“彗星”区分。MarkS.Rundell等(2003)报道彗星试验测行的损伤主要是由致突变剂引起的[20]。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一种新的分析试验结果的彗星尾图谱,可以更加准确的分析彗星的长度及密度[21]。SCGE是评价遗传毒性损害非常敏感的实验,可以检测到每1.657×10-37kg中0.1个DNA的断裂。与经典的染色体畸变、微核、SCE相比,SCGE可以用于活细胞DNA的检测,也能用于死亡细胞DNA的分析,使SCGE不仅可以研究低剂量下的生物效应,也可用于研究高剂量下的生物效应;同时SCGE又可提供DNA修复能力的信息,这使得SCGE非常适用于评价受试物的遗传毒性