质粒dna的转化用的什么方法

① 质粒在细菌间的转移方式主要是

质粒在细菌间的转移方式主要是

接合

质粒在细菌间的转移方式主要是接合，通过性菌毛的作用从供体菌传递给受体菌。

1、接合闷咐陆作用：当细菌与细蚂顷菌相互接触时，质粒DNA就可从一个细菌转移到另一个细菌。

2、转化作用：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的简燃过程，称为转化作用。

3、转导作用：当病毒从被感染的细胞释放出来，再次感染另一细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

4、转座（转位）：转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。可分为插入序列转座和转座子转座。

5、基因重组：不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。有两种类型：位点特异的重组和同源重组。

基因水平转移的形成因素：

1、由质粒或病毒等介导的水平基因转移质粒和病毒是在各生物间进行遗传物质传递的重要媒介。

2、基因的“直接”水平转移水平基因转移除了通过质粒和病毒为媒介以外，大量发现的是不需要媒介的“直接”转移。

3、基因组序列分析和水平基因转移随着基因工程的深入开展，人类及其它生物基因组测序工作相继完成，人们发现不同物种之间，甚至亲缘关系很远的生物之间基因组上有大量同源基因存在。

4、水平基因转移与进化由前可知，水平基因转移实际上已被引入了分子进化及宏观进化领域，被认为是推动进化的重要动力。

② 质粒DNA的提取方法总共有哪些，回答的全给高分

(一)碱裂解法提取质粒
[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[实验仪器与设备]
1.恒温培养箱 2.恒温摇床
3.台式离心机(最大转速4000rpm) 4.冷冻高速离心机
5.高压灭菌锅 6.超净工作台
7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip
[实验材料]
1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠
5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾
7.冰乙酸 8.氯仿
9.乙醇 10.胰RNA酶
11.氨苄青霉素 12.蔗糖
13.溴酚蓝 14.酚
15.β巯基乙醇 16.盐酸
17.含pUC18质粒的大肠杆菌
附：试剂的配制
1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)
10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸钾 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4.TE缓冲液
10mmol/L Tris·HCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
6.胰RNA酶
将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚
8.酚
[实验步骤]
(一) 提取质粒
1.将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000rpm，离心2min。
3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4.将细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10 min。
5.加200μl溶液Ⅱ(新鲜配制)，混匀内容物，将离心管放冰上5 min。
6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。
7.1200rpm，离心15 min，将上清转至另一离心管中。
8.向上清中加入等体积酚：氯仿(去蛋白)，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中.
9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
11.加50μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
(二)琼脂糖凝胶电泳检测DNA
[实验原理]
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭(ethim bromide ,EB)，在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：
(1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
(5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。
(6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。
[实验仪器与设备]
1. 恒温培养箱 2. 琼脂糖凝胶电泳系统
3. 高压灭菌锅 4. 紫外线透射仪
[实验材料]
1.三羟甲基氨基甲烷(Tris) 2.硼酸
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝
5.蔗糖 6.琼脂糖
7.溴化乙锭 8.DNA marker
9.DNA样品
[实验步骤]
1.缓冲液的配制
① 5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
② 凝胶加样缓冲液(6×)
溴酚蓝 0.25%
蔗糖 40%
③溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/ml
2.制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：
琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围
0.3% 5-60 kb
0.6% 1-20 kb
0.7% 0.8-10 kb
0.9% 0.5-7 kb
1.2% 0.4-6 kb
1.5% 0.2-4 kb
2.0% 0.1-3 kb
3.胶板的制备
(1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所皿备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正)。
(2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液(1×TBE)。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率 。
(3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。
(4) 使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存液)到终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。
(5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。
(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。
(7)在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45分钟) ，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。
低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。
(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。
4.加样
DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。 一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μl样品。
已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。
5.电泳
在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。

③ dna转化有哪些方式合有何优点

DNA转化的范围较广，但以植物细胞中的转化为主，现将其方式及优点阐述如下：

1、农杆菌介导基因转化：

• 转化原理:农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

• 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。

2、基因枪转化：

• 转化原理：利用火药爆炸或高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。

• 特点：基因枪转化率差异很大，相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高，嵌合体比率大，遗传稳定性差。它的一个主要优点是不受受体植物范围的限制，而且其载体质粒的构建也相对简单。

3、花粉管通道法：

• 转化原理：在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

• 特点：不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

④ 用氯化钙法将质粒DNA转化入大肠杆菌实验中，转化成功的关键因素有哪些

影响转化效率的因素很多，主要有：感受态细胞制备的质量、受体菌生长期（大肠杆菌在对数生长期易产生感受态）、质粒的大小和构型、所用试剂的纯度、接种前菌种的保藏方式、冰浴时间（延长冰浴时间可略微提高转化率）、器皿的清洁度、化合物及无机离子（rb+、mn+、如燃二甲基亚砜能适当提高转化率）、质粒与细胞个数的比例（质粒与细胞个数比例在1:1以下时，转化率随着加入dna的量增加而呈线性增加）。
注意事项：
（1）细胞生长状态和密度。密度不足或过高会使转化率下降。
（2）质粒dna的质量和浓度。用于转化的质粒dna应主要是共价闭环dna。转化率与外源dna的浓度在一定范围内成正比，量过多货体积过大时，转化率下降。
（3）试剂的质量。
（4）防止杂菌和其他外源键橡正dna的污染。
（5）根据所需质粒dna的特性，设置相应的选择性培养基进稿悔行筛选，有的可能还需进行多补筛选。

⑤ 质粒的转换的方法有哪些质粒转化后如何筛选

转化的方法：最常用的是感受态法，包括热激和电转化等，转染不是转化，这是不同的概念。

转化后，可以根据质粒上带有的某种特殊基因的表达来鉴定菌落，最常用的有：抗药性基因的表达，比如质粒带有氨苄抗性基因，能在AMP平板上长的一般可以初步判断为转化成功的菌；还有就是显色筛选，比如质粒上的LacZ基因表达，间接促使添加了X-gal的培养基变蓝，绿色荧光蛋白基因表达后菌落发荧光等。

⑥ 质粒转化步骤

质粒的转化，满满干货
原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。

感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

质粒的转化主要包含

Ⅰ感受态细胞制备

Ⅱ质粒DNA转化

Ⅲ质粒DNA的提取

（Ⅰ）感受态细胞制备

1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。

3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min（4000r/min）。

4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）

6）4℃离心10min（4000r/min）。

7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。

8）可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。

（Ⅱ）质粒DNA的转化

1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。

冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。

2）冰浴30min，离心管放到42℃保温90s（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。

3）向离心管加800ulLB液体培养基，37℃振荡培养1h（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。

4）取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30min。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16h，出现菌落。

5）菌落结果：

① 无菌落

失败或者培养条件不充分

② 布满菌落,

呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致

③ 布满菌落

浓度太高，失败

④ 出现菌落

符合要求

Ⅲ）质粒DNA的提取

质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解，能够避免实验过程中的一些问题，或者能够更好的解决问题。

各厂家提供的试剂盒中试剂不尽相同，一般的提取纯化试剂盒，主要包括以下试剂：

A. 细胞悬浮试剂: 主要作用是将菌体细胞悬浮起来。菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒的提取纯度和得率都会下降。通常需要在里面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常选用Tris-HCl作为体系中pH稳定缓冲液。EDTA，金属离子螯合剂可以和细菌体内的金属离子结合而DNase的活性受到抑制。有的会有葡萄糖，可用来增加溶液粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉淀时间。

B. 细胞裂解试剂：主要作用是裂解细胞，通过碱溶液的作用破坏细胞膜结构，使其双层膜结构改变，而导致细胞裂解。一般由一定浓度的NaOH和SDS组成。SDS的作用与后期中和过程中清除掉蛋白质等细胞杂质有关系。此步骤中需要注意的是，碱溶液的作用时间不能太长，也不可剧烈离心管，反之会导致碱破坏基因组DNA，导致同等大小的基因组DNA被提纯，造成污染。

C. 中和试剂：主要作用使中和掉细胞裂解试剂中的碱性物质，并去除掉其中的蛋白等杂质物质。组份有醋酸钾和醋酸，或者乙酸钾和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的盐离子。DNA被试剂盒中的提取柱吸附之后，需要用wash buffer 洗脱掉多余的盐离子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇对后续酶切和测序反应会有影响，因此在后续洗脱DNA前，必须完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脱Buffer: 主要作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。

1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通过重力的作用，使平衡buffer都流出。

2.细胞收获：对于高拷贝质粒（培养液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培养液,离心去上清；对于低拷贝质粒（培养液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培养液，离心去上清。

3. 细胞悬浮：加0.4mL的细胞悬浮液(containing RNase A)悬浮细胞，并使其混匀。

4. 细胞裂解：加入0.4mL细胞裂解液，通过上下颠倒带盖子管子5次使其轻轻混匀，不要涡旋，之后在室温下放置5min.

5. 中和：加入0.4mL的中和试剂，立即混合均匀。当大的细胞颗粒被处理后，可能会进行更剧烈的摇动。但是，不要涡旋！~12,000xg离心混合物10min. 如果是采用的4°离心，上清液需要恢复到室温，再加入到柱子中。

6. 装柱：吸取步骤5中的上清液到平衡柱中。让混合液通过重力的作用流出，弃掉流出液。

7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脱柱子量次。每次清洗让清洗液通过重力的作用流出，弃掉流出液

8. 质粒DNA洗脱：加入0.9mL的Elution Buffer。让Elution Buffer通过重力的作用流出。不要强行弄出里面的液体。

9. 质粒DNA沉淀：加入0.63mL异丙醇去析出，混匀，~12,000xg at/4°C离心30min。小心的去掉上清，之后风干10分钟

10. DNA纯化：将管子中的DNA溶解到TE buffer中。将这些溶液转移到新管中。

重组质粒鉴定的方法：

① 双酶切后跑电泳；直接DNA电泳可判断整个DNA重组质粒是否正确。② PCR(插入片段在2kb以下时)，然后电泳。

③ 送公司测序（最为准确的鉴定方式）。

影响转化效率的因素：

① 细胞状态和细胞密度: 培养菌最好选用传代次数少，且保存于-70℃或者-20℃。不要使用经过多次转接或者保存于4℃环境中培养菌。细胞生长密度以刚进入对数其为最好，可通过检测培养液的OD600值来判断，密度过高或者不足，都会影响转化效率。通常DH5α菌株在OD600的值为0.5左右，细胞密度在5*107个/ml左右比较合适。密度过高或者不足均会影响转化效率。

② 质粒的质量和浓度：转化的质粒DNA中，超螺旋状态的质粒，转化效率最好。在一定浓度范围内，转化的效率与添加质粒的浓度成正比。不过在添加的质粒的量和体积过大的时候，转化效率也会降低。质粒的分子量越大，通常来说转化率也会降低。

③试剂的质量：转化过程中所用的试剂，如氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率。

④防止杂菌和DNA污染：实验需要在无菌条件下进行，所用的仪器和试剂均需要灭菌处理，并防止在实验过程中引入其他污染。

⑤培养过程的条件：培养瓶中培养基的量关乎到菌体生长过程中的能量代谢。通常来说厌氧环境做出来的感受态的转化效率较低。建议500ml三角瓶液体培养基量不超过100ml, 250ml三角瓶液体培养基量不超过50ml. 培养基的pH值要适宜，接种前一般pH值在6.8-7.2，等培养结束后可以再测一下pH值最好在6.5以上（不低于6.0），表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。培养基中的各种离子和温度，也对形成好的感受态有关系。

几种扩增常用感受态细胞：

① 普通骨架载体cDNA产品

DH5α：常用于质粒克隆，可用于蓝白斑筛选

TOP10：适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能够保证高拷贝质粒的稳定遗传。

TG1: 生长速度快，常用于噬菌体的制备，同时也可用于普通质粒的构建。

CopyCutter：适用于有毒克隆。

② 慢病毒载体质粒：

Stbl3: 是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率

Stable（NEB）：可用于逆转录病毒/慢病毒载体系统扩增。

⑦ 质粒的提取原理

质粒提取是指去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

目录

一、质粒提取原理

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。

在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。

质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。

二、质粒提取方法

质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。

(一) 碱裂解法：

此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：

1. 接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2. 37℃振荡培养过夜。

3. 取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4. 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5. 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6. 加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7. 以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8. 加入等体积的异戊醇，混匀后于0℃静置10min。

9. 再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10. 用70％乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11. 待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中

(二) 煮沸法：

1. 将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。

2. 弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3. 将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中，涡旋混匀。

4. 加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 涡旋振荡3秒钟。

5. 将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6. 用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7. 用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8. 取20ml进行电泳检查。

(三) 酚氯仿裂解法：

1. 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30 μg/mL）摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0。22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。

2. 按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1 h）。 酶切产物10 μL，10 g/L琼脂糖凝胶电泳。

3. PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714 bp。

4. 常规制备感受态菌E。coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30 μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况。

三、质粒提取常见问题

(一) 溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：1. 螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;2. EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

(二) 溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：1. 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。2. 解聚细胞中的核蛋白。3. SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

(三) 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

(四) 为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

(五) 在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

(六) 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？

加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

(七) 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

(八) 如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最终PEG浓度为12％。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。

(九) 抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

(十) 为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

(十一) 为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？

因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

(十二) 未提出质粒或质粒得率较低？

1. 大肠杆菌老化

请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2. 质粒拷贝数低

由于低使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷

贝数载体。

3. 菌体中无质粒

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时

应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4. 碱裂解不充分

使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、

P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能

有助于增加质粒提取量和质粒质量。

5. 溶液使用不当

溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的

溶液，才能使用。

6. 吸附柱过载

不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若

用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高

的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。

7. 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8. 乙醇残留

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加

入洗脱缓冲液。

9. 洗脱液加入位置不正确

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱

效率。

10. 洗脱液不合适

DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5)

或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保

其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱

缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

11. 洗脱体积太小

洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降

低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

12. 洗脱时间过短

洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。

(十三) 质粒纯度不高？

1. 混有蛋白

不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有

微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。

2. 混有RNA

RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如

果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。

3. 混有基因组DNA

加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从

而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用

量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16 小时。

4. P3溶液加入时间过长

P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。

5. 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完

整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。

6. 裂解时间过长

加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。

7. 质粒的二聚体和多聚体形式

质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。