细胞周期研究方法

⑴ 如何在观察根尖分生组织细胞的有丝分裂计算细胞周期

细胞周期中每个时期分别所经历的时间长短，
每一时期的时间=细胞周期x每一时期的细胞数占计数细胞总数的比例

实验目标
1、初步掌握制作根尖细胞有丝分裂装片的技术。
2、观察植物细胞有丝分裂的过程，识别分裂的不同时期。
3、初步掌握绘制生物图的方法。

实验原理
细胞的有丝分裂是一个连续动态的变化过程，但可以通过它的形态变化，特别是细胞核中的染色体行为，人为地划分阶段，并进行比较研究。在自然状态下，一大群处于各个分裂期的细胞混杂在一起。必须仔细观察，寻带瞎找有丝分裂过程各期典型形态特征的细胞，从而建立起细胞周期的概念。植物的分生组织（如根尖分生区、茎尖生长点等）细胞，能够通过有丝分裂增加其数目。依据植物细胞分裂周期中各个时期细胞中染色质或染色体的形态、数目、位置变化，确定该细胞所处的时期。为了看清染色体或染色质，要用碱性染料将其染色。

实验材料
蚕豆、蒜和葱的根尖。

试剂仪器
洋葱鳞茎，镊子，刀片，培养皿，载玻片，盖玻片，滴管，纱布，吸水纸，酒精灯，显微镜；固定液，15%盐酸，醋酸洋红染液，95%乙醇。

方法步骤
1、嫌洞洋葱根尖的培养
（1）培养洋葱生根时，避免用新采收的洋葱，因它尚在休眠不易生根。如果必须用当年刚采收的新洋葱培养生根，则应设法打破它的休眠。常用的方法是用低浓度的赤霉素溶液浸泡洋葱底盘，这样可以促使其生根。培养过程中，注意每天至少换水一次，以防烂根。
（2）对于头年收下的洋葱，可以采用如下方法促使它生根：
①选择底盘大的洋葱作生根材料。
②剥去外层老皮，用刀削去老根（从底盘中央向四周削），注意不要削掉四周的“根芽”。
③用烧杯装满清水，放上洋葱，放置在光照处。水要保持清洁，注意每天换水l～2次。一般2～3d即可获得实验所需材料（根长5cm）。
（3）固定时间取材。洋葱根尖细胞有丝分裂的时间是有规律的。通常在每天上午10时至下午2时分裂活跃，尤其以下午2时最活跃，可在这时取材。可以把培养好的洋葱根用卡洛氏固定液固定起来备用。因为培养一次洋葱根不容易。
2、解离。用刀片切下长约2～3mm的根尖，放入盛有15%盐酸和体积分数为95%的酒精溶液的混合液（1︰1）的培养皿中，解离3～5min，使根尖组织的细胞相互分开，待根尖透明酥软即停止解离。如果要使解离加快，可以把培养皿放在酒精灯上微微加热（不可煮沸）3～5 min。待根酥软后，用镊子取出。解离充分是实验成功的必备条件；解离的目的是用药液溶解细胞间质，使组织细胞相互分离开。
3、漂洗。把取出的根尖放入清水漂洗约10min，也可以在培养皿口上蒙上—层纱布，用自来水细小的水流漂洗3～5min。漂洗的目的是洗去根中多余的解离液。如果不把多余的解离液洗去，一方面会影响染色效果，因为解离液中含有HCl溶液，而用来染色的染料呈碱性；另一方面还会腐蚀显微镜的镜头。
4、染色。把漂洗好的根尖置于载玻片上，用镊子头截下长约3mm的根尖，其余部分丢弃，在根尖上滴一滴醋酸洋红染液染色3～5min，如果要使染色加快，可把载玻片在酒精灯的火焰上快速过几下（不可煮沸）。
5、装片。在染好色的材料上盖上盖玻片，上面再覆一片载玻片，用拇指轻轻压一下，使根尖组织成为均匀薄层的细胞层。
6、镜检
（1）低倍镜观察
把制成的洋葱根尖装片先放在低倍镜下观察，慢慢移动装片，找到分生区细胞，其特点是：细胞呈正方形，排列紧密，有的细胞正在分裂。
（2）高倍镜观察
找到分生区细胞后，把低倍镜移走，换上高倍镜，用细准焦螺旋和反光镜把视野调整清晰，直到看清细胞物像为止。
（3）仔细观察
仔细观察的目的是区芹行枯分细胞分裂中各个时期内染色体变化的特点。可先找出处于细胞分裂中期的细胞，然后再找出前期、后期、末期的细胞，处于间期的细胞数目最多，最容易找到。
（4）在一个视野里，往往不容易找全有丝分裂过程中各个时期的细胞。如果是这样，可以慢慢地移动装片，从邻近的分生区细胞中寻找。
7、绘图。在仔细观察清楚有丝分裂各个时期的细胞的以后，绘出洋葱根尖细胞有丝分裂的简图。

注意事项
1、培养产生洋葱根尖的材料是洋葱鳞茎。鳞茎底部接触水，不能离开水，也不能被水淹。其目的是同时满足其对水和空气的需要。同时要经常换水，因为水中由于微生物的活动和根细胞的活动，代谢产物增多；此外，还由于根细胞的呼吸不断产生CO2，使水中H2CO3增多，氧气缺少；微生物，如细菌的大量繁殖也使水质受到污染，这些都不利于根尖生长，所以要经常换水。—般一天至少一次，还要提供适宜的温度。
2、剪取洋葱根尖材料时，应该在洋葱一天之中分裂最活跃的时间，一般在上午11点左右。如果因气温影响或不在—上述时间做实验的话，可以在细胞有丝分裂最盛时取材，放人盛有固定液的培养皿中固定，即浸泡半天到一天。固定后用75%乙醇冲洗几次，再放入盛有70%乙醇的小广口瓶中保存。注意要等根尖长到l～5cm时才能切取，而切取的洋葱根尖长度是2～3mm。根据实验得知，根长到1～5cm时，根的长势最佳，此时细胞分裂最旺盛，容易找到不同时期的分裂图象。此时可取生长健壮的根进行观察，切取洋葱根尖2～3mm，这个长度要从根的顶端（根冠）开始算起，这个长度已将分生区包括了进来。若取材过长，在低倍镜下寻找分生区就会很困难。
3、根尖培养好以后，装片制作是否成功，关键的步骤是解离。15%的盐酸溶液能溶解细胞壁之间的中层物质（胞间质），使组织中的细胞相互分开。否则，在显微镜下观察时，细胞将发生重叠现象，导致实验失败。解离不充分，细胞重叠；解离过度，细胞会腐烂，所以解离要适度。为达到这一目的，配制的盐酸浓度要适宜，切取的根尖应立即放入15%的盐酸中，在室温下解离10～15min。解离时间要视室内温度而定，温度低，时间稍长，温度高，时间短。也可手拿镊子，轻轻按正在解离的根尖，感觉酥软即可。
4、漂洗的目的是洗去根中多余的解离液。如果不把多余的解离液洗去，一方面会影响染色效果，因为解离液中含HCl，而用染色的染料呈碱性；另一方面还会腐蚀显微镜的镜头。
5、染色时，染色液的浓度和染色时间必须掌握好。特别是染色不能过深，否则镜下一片紫色，无法观察。也不能过浅，否则染色质和染色体的形态和数目不易辨清。
6、制片时，一方面要用镊子把洋葱根尖弄碎，另一方面要压片，这样可以使细胞分散开来。压片时，在盖玻片上再加一片载玻片的目的，一是避免压碎和移动盖玻片。二是使压力大小适中，从而使组织细胞均匀分散。同时用力必须恰当，过重时会将组织压烂，过轻则细胞未分散开，二者都将影响观察。
7、结果与讨论
在显微镜的一个视野中看到的细胞，多数处于细胞有丝分裂的间期，因为在一个细胞周期中，间期所占的时间占整个细胞周期的90%一95%，时间与细胞数目成正比。另外，在一个视野中，往往不容易找全有丝分裂过程中各个时期的细胞，可以慢慢地移动装片，从邻近的分生区细胞中寻找。
拓展：有丝分裂（mitosis），又称做间接分裂，由W. Fleming于1882年首次发现于动物及E. Strasburger（1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物（动物和高等植物）。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。动物细胞（低等植物细胞）和高等植物细胞的有丝分裂是不同的。
分裂间期
有丝分裂间期分为G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期） 三个阶段，其中G1期与G2期进行RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成，S期进行DNA的复制；其中，G1期主要是染色体蛋白质和DNA解旋酶的合成，G2期主要是细胞分裂期有关酶与纺锤丝蛋白质的合成。在有丝分裂间期，染色质没有高度螺旋化形成染色体，而是以染色质的形式进行DNA（即脱氧核糖核酸）单链复制。有丝分裂间期是有丝分裂全部过程重要准备过程，是一个重要的基础工作。（现代医学，利用有关药物，制止了细胞中的纺锤丝的形成，从而抑制了细胞的有丝分裂，使细胞分裂停止于G0（G0阶段指因某些因素使细胞分裂停止，改变外因可使细胞重新进行分裂的时期）阶段，利用该技术的有关药物有效地遏制了癌细胞的恶性增殖和扩散。）

分裂期
前期 （prophase）
自分裂期开始到核膜解体为止的时期。间期细胞进入有丝分裂前期时，细胞核的体积增大，由染色质构成的细染色线螺旋缠绕并逐渐缩短变粗，形成染色体。因为染色质在间期中已经复制，所以每条染色体由两条染色单体组成，即两条并列的姐妹染色体，这两条染色单体有一个共同的着丝点连接。核仁在前期的后半期渐渐消失。在前期末核膜破裂，于是染色体散于细胞质中。动物细胞有丝分裂前期时靠近核膜有两个中心体。每个中心体有一对中心粒和围绕它们的亮域，称为中心质或中心球所组成。由中心体放射出星体丝（又叫纺锤丝），即放射状微管。带有星体丝（纺锤丝）的两个中心体逐渐分开，移向相对的两极（图1）。这种分开过程推测是由于两个中心体之间的星体丝（纺锤丝）微管相互作用，更快地增长，结果把两个中心体（两对中心粒）推向两极，而于核膜破裂后终于形成两极之间的纺锤体。
前中期
自核膜破裂起到染色体排列在赤道面上为止。核膜的断片残留于细胞质中，与内质网不易区别，在纺锤体的周围有时可以看到它们。前中期的主要过程是纺锤体的最终形成和染色体向赤道面的运动。纺锤体有两种类型：一为有星纺锤体，即两极各有一个以一对中心粒为核心的星体，见于绝大多数动物细胞和某些低等植物细胞。一为无星纺锤体。两极无星体，见于高等植物细胞。曾经认为有星纺锤体含有三种纺锤丝，即三种微管。一种是星体微管，由星体散射出的微管；二是极微管，是由两极分别向相对一级方向伸展的微管，在赤道区来自两极的极微管互相重叠。认为极微管可能是由星体微管伸长形成的。三是着丝点微管，与着丝点联结的微管，亦称着丝点丝或牵引丝。着丝点是在染色体的着丝粒的两侧发育出的结构。有报告说着丝点有使微管蛋白聚合成微管的功能。无星纺锤体只有极微管与着丝点微管。
核膜破裂后染色体分散于细胞质中。每条染色体的两条染色单体其着丝点分别通过着丝点与两极相连。由于极微管和着丝微管之间的相互作用，染色体向赤道面运动。最后各种力达到平衡，染色体乃排列到赤道面上。
中期 （metaphase）
从染色体排列到赤道板上，到它们的染色单体开始分向两极之前，这段时间称为中期。有时把前中期也包括在中期之内。中期染色体在赤道面形成所谓赤道板。从一端观察可见这些染色体在赤道板呈放射状排列，这时它们不是静止不动的，而是处于不断摆动的状态。中期染色体浓缩变粗，显示出该物种所特有的数目和形态。因此有丝分裂中期适于做染色体的形态、结构和数目的研究，适于核型分析。中期时间较长。
后期 （anaphase）
每条染色体的两条姊妹染色单体分开并移向两极的时期。分开的染色体称为子染色体。子染色体到达两极时后期结束。染色单体的分开常从着丝点处开始，然后两个染色单体的臂逐渐分开。当它们完全分开后就向相对的两极移动。这种移动的速度依 细胞种类而异，大体上在0.2～5微米/分。平均速度约为为 1微米/分。同一细胞内的各条染色体都差不多以同样速度同步地移向两极。子染色体向两极的移动是靠纺锤体的活动实现的。
末期 （telophase）
从子染色体到达两极开始至形成两个子细胞为止称为末期。此期的主要过程是子核的形成和细胞体的分裂。子核的形成大体上是经历一个与前期相反的过程。到达两极的子染色体首先解螺旋而轮廓消失，全部子染色体构成一个大染色质块，在其周围集合核膜成分，融合而形成子核的核膜，随着子细胞核的重新组成，核内出现核仁。核仁的形成与特定染色体上的核仁组织区的活动有关。 细胞体的分裂称胞质分裂。动物和某些低等植物细胞的胞质分裂是以缢束或起沟的方式完成的。缢束的动力一般推测是由于赤道板的细胞质周边的微丝收缩的结果。微丝的紧缩使细胞在此区域产生缢束，缢束逐渐加深使细胞体最后一分为二。高等植物细胞的胞质分裂是靠细胞板的形成。在末期，纺锤丝首先在靠近
两极处解体消失，但中间区的纺锤丝保留下来，并且微管增加数量，向周围扩展，形成桶状结构，称为成膜体。与形成成膜体的同时，来自内质网和高尔基器的一些小泡和颗粒成分被运输到赤道区，它们经过改组融合而参加细胞板的形成。细胞板逐渐扩展到原来的细胞壁乃把细胞质一分为二（右图）。细胞质中的有关细胞器，如线粒体，叶绿体等不是均等分配，而是随机进入两个子细胞中。细胞板由两层薄膜组成，两层薄膜之间积累果胶质，发育成胞间层，两侧的薄膜积累纤维素，各自发育成子细胞的初生壁。

动植物比较

不同
动物细胞有丝分裂的过程，与植物细胞的基本相同，不同的特点是：
1.动物细胞有中心体，在细胞分裂的间期，中心体的两个中心粒各自经过中心粒复制新的中心粒，因而细胞中有两组中心粒。在细胞分裂的过程中，两组中心粒分别移向细胞的两极。在这两组中心粒的周围，发出无数条星射线,两组中心粒之间的星射线形成了纺锤体。
2.动物细胞在有丝分裂间期中心体复制，植物细胞中心体则没有复制。（高等植物没有中心体）
3.植物细胞分裂末期，在赤道板部位出现细胞板，并由中央向周围扩展形成细胞壁。动物细胞分裂末期，赤道板处细胞膜向内凹陷，缢裂成两个细胞。
有丝分裂的重要意义，是将亲代细胞的染色体经过复制（实质为DNA的复制）以后，精确地平均分配到两个子细胞中去。由于染色体上有遗传物质DNA，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。

相同
动物细胞有丝分裂的过程与植物细胞的分裂过程存在一个十分重要的相同点：
无论是动物细胞分裂过程还是植物细胞分裂过程都会有染色体的出现和纺锤体的形成。（植物：无星射线纺锤体；动物：星射线纺锤体）。染色体复制后平均分配。

⑵ 细胞周期通路

一般而言， 细胞周期可以分为四个时相： G1(DNA 合成前期)； S 期（ DNA 合成期） ； G2 期（ DNA 合成后期） 和 M 期（ 有丝分裂期） 。 有知陪些学者把某些从G1 期退出细胞周期但是仍然存活， 在适当刺激后还能再次进入细胞周期的一类细胞， 称为G0 期。 所以如果把 G0 期细胞也算上， 细胞周期可以分为 5 个时相。 在实际的研究工作中，为了简化细胞周期， 也常常根据染色体的倍数进行分类： G0/G1 期细胞因为在 DNA 复制过程之前， 因此细胞内染色体是二倍体（ 2N） ； S 期细胞正在进行 DNA 的复制， 但是整个DNA 复制的过程并没有全部完成， 因此细胞内染色体介于二倍体和四倍体之间； G2/M 期的细胞已经完成了 DNA 复制过程， 因此细胞内染色体是四倍体（4N） 。 所以如果根据染色体的倍数进行分类， 细胞周期的时相可以分为： G0/G1 期、 S 期和 G2/M 期三个时相。

1） 是 G1/S 期检查点； 2） 是 G2/M期检查点。

整个过程的精准调控。
Cyclin 和 CKI 都能调控 CDK， 但是 Cyclin 正向调控 CDK； 而 CKI负向调控 CDK。G1 期主要表达的 Cyclin 分子是 Cyclin D 和 Cyclin E。Cyclin D 可以和 CDK4或者 CDK6 相互结合； Cyclin E 主要和 CDK2 相互结合。 S 期主要表达 Cyclin A， 它也是和CDK2 相互结合。 M 期主要表达 Cyclin B， 它主要和 CDK1 相互结合。 CKI 可以分为两类 Ink4（代表分子： p16、 p 15、 p18 和 p19） ； 另一类是 KIP（包括 p21， p27 和 p57） 。

在 Rb 调控通路中，生长因子慧春结合相应的受体， 促进 Cyclin 表达； Cyclin 与相应 CDK 结合形成复合物， 促进
Rb 蛋白磷酸化， 磷酸化的 Rb 释放核转录因子 E2F， 游离的 E2F 进入核内， 促进下游基因的转录表达。 在 p53 调控通路中， p53 主要在 G1 检查点上发挥重要作用。 最常见的作用机制和通路是： p53 可作为转录因子结合到 p21 的启动子区域并激活 p21 基因转录。 当细胞DNA 受损后， p21 基因在 p53 诱导下表达水平升高， 抑制 CDK 活性， 阻止细胞从 G1 期进入 S 期， 使细胞停止于 G1 期。

1） 检测细胞周期相关的明星分子（例如： Cyclin、 CDK、CKI 以及相应的信号通路中的明星核心分前猛耐子） ； 2） 是通过 PI 染色实验， 采用流式细胞仪检测细胞周期的变化。

⑶ 细胞周期测定实验有哪些，怎么做

细胞计数法

实验方法原理： 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

实验步骤：

一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

三、取出盖片，按下列顺序操作：

PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

五、计算

分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%

BrdU参入法

实验方法原理： 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一橡闹半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

一、试剂配制

二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。

三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

五、常规染色体制片。

六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。

七、弃去2×SSC液，流水冲洗。

八、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

九、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

十、计算

细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）

细胞周期 （cell cycle) 是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。

1.间期

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

（1）G1期

此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。

（2）S期

S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。S期一般需几个小时。

（3）G2期

为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定，需用1～1.5小时。

2.分裂期

细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程梁庆罩，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

（1）前期（prophase） 染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

（2）中期（metaphase） 细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到差做完整的染色体群，共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46，XY，女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

（3）后期（anaphase） 由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。

（4）末期（telophase） 染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合

为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

在体内根据细胞的 分裂能力 可把它们分为三类：

①增殖细胞群 ，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环。

②不再增殖细胞群 ，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）。

③暂不增殖细胞群 ，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。

流式细胞仪

实验方法原理： 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。

实验步骤：

一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心15 min去上清。

二、PBS洗2次，加0.5 mLPBS吹匀，务必吹散。

三、用5 mL注射器将细胞吸起，用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。

四、800 rpm 15 min收集固定细胞，PBS洗2次。

五、用0.4 mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）。

六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50μg/mL ，37℃水浴消化30 min；

七、加PI约50 μL至终浓度约为65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

八、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。

九、样品分析测定及打印。

常见问题

1.Q：胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？

A：以乳腺细胞的DNA含量测定为例，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.

2.PI分析细胞周期及凋亡率相关问题

Q： （1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？

A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q： （2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？

A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定。

Q： （3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。

Q： （4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。

3.Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？

A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI

  4度孵育30min”。至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。

4.Q：肿瘤细胞测周期。70％乙醇是否必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，PBS和乙醇配会出现絮状物？上流式前细胞用75％乙醇固定，使用瓶装75％乙醇是否可行？

A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

5.Q：流式分析细胞周期，收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现看不到细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？

A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：

（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机

（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。

（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿

（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

⑷ 在研究细胞周期时，可以用BrdU进行标记．将细胞置于含有BrdU的某种培养基中培养，当细胞的DNA复制时，Brd

（1）根据题意分析，若观察到置于含有BrdU的某种培养基中培养的细胞中所有染色体上的两条姐妹染色单体着色深，说明每条染色单体的DNA两条链中只有一条链中具有BrdU，另一条链中肯定没有BrdU．染色体复制一次，则该细胞正处于第一指或个细胞周期的中期．
（2）若细胞中的所有染色体上的两条姐妹染色单体一条着色深、一条着色浅，说明一条染色单体的DNA两条链中只有一条链中具有BrdU，另一条链中肯定没有BrdU．另一条染色单体的两个DNA两条链都具有BrdU，此时细胞每条染色体中有3条脱氧核苷酸链含有BrdU，染色体复制两次．
（3）姐妹染色单体之间的交换发生在减数分裂，对于四分体中的一对同源染色体A、B，我们不妨设A的两条染色单体是a1、a2，其中a2中含有BrdU；B的两条染色单体是b1、b2，其中b1、b2中都含有BrdU．且两者之间发生部分基因的交换，交换后会出现染色体上着色深的染色单体中含有着色浅的染色单体片段，着色浅的染色肢逗脊单体中含有着色深的染色单历渗体片段．
（4）癌细胞是不断分裂细胞，记忆细胞在受到抗原刺激后能迅速增殖分化，叫暂不增殖细胞，效应T细胞是不再分裂的细胞；
（5）①鸡成纤维细胞在体外培养时进行的是有丝分裂，B组实验说明了37℃时tsRSV基因组中的癌基因能表达致癌．
②DNA杂交利用碱基互补配对原则，些高度相似的序列在正常情况下与细胞的分裂分化有关，叫做原癌基因．
故答案为：
（1）一
（2）二32
（3）染色体上着色深的染色单体中含有着色浅的染色单体片段，着色浅的染色单体中含有着色深的染色单体片段
（4）①③②
（5）①有丝分裂37℃时tsRSV基因组中的癌基因能表达致癌
②碱基互补配对原则原癌基因

⑸ 细胞周期的表示方法

细胞周期的表示方法：画图法。

细胞周期的重要性：

以有丝分裂方式增殖的细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程。这一过程周而复始。

细胞周期是50年代细胞学上重大发现之一。细胞生命活动大部分时间是在间期度过的，如大鼠羡盯角膜上皮细胞的细胞周期内，间期占14000分钟。分裂期仅占70分钟。细胞周期各阶段都有复杂的生化变化。

间期是细胞合成DNA、RNA、蛋白质和各种酶的时期，是为细胞分裂准备物质基础的主要阶段。在这之前认为有丝分裂期是细胞增殖周期中的主要阶段，而把处于分裂间期的细胞视为细胞的静薯旅止阶段。

细胞周期也受机体调节系统的影响，例如肝再生就是由调节系统的作用加速肝细胞增殖。但是肿瘤细胞，由于宿主失去对它的调控，因而恶性增殖。在肿瘤治疗中可应用细胞周期的原理。

如G0期细胞对化疗不敏感，往往成为日后癌症复发的根源，因而可通过调控机理的研究，诱发G0期癌细胞进入细胞周期，再合理用抗癌药物加以杀灭，是防止癌转移和扩散的重要调控措施，是细胞动力学中有理论意义和实践意义的研究问题。

总之，至今所了解的细胞增殖调控的分子基础还少，尚待进一步探索。

⑹ 细胞周期包括哪几个阶段

1、分裂间期有丝分裂间期分为G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期） 三个阶段，其中G1期与G2期进行RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成，S期进行DNA的复制；其中，G1期主要是染色体蛋白质和DNA解旋酶的合成，G2期主要是细胞分裂期有关酶与纺锤丝蛋白质的合成。

在有丝分裂间期，染色质没有高度螺旋化形成染色体，而是以染色质的形式进行DNA（即脱氧核糖核酸）单链复制。有丝分裂间期是有丝分裂全部过程重要准备过程，是一个重要的基础工作。

2、细胞有丝分裂前期是指自分裂期开始到核膜解体为止的时期。

间期细胞进入有丝分裂前期时，细胞核的体积增大，由染色质构成的细染色线螺旋缠绕并逐渐缩短变粗，形成染色体。因为染色质在间期中已经复制，所以每条染色体由两条染色单体组成，即两条并列的姐妹染色体，这两条染色单体有一个共同的着丝点连接。核仁在前期的后半期渐渐消失。在前期末核膜破裂，于是染色体散于细胞质中。

3、中期是指从染色体排列到赤道板上，到它们的染色单体开始分向两极之间的时期。有时把前中期也包括在中期之内。

中期染色体在赤道面形成所谓赤道板。从一端观察可见这些染色体在赤道板呈放射状排列，这时它们不是静止不动的，而是处于不断摆动的状态。中期染色体浓缩变粗，显示出该物种所特有的数目和形态。因此有丝分裂中期适于做染色体的形态、结构和数答旁渗目的研究，适于核型分析。而且中期时间较长。

4、后期是指每条染色体的两条姐妹染色单体分开并移向两极的时期。在后期被分开的染色体称为子染色体。子染色体到达两极时后期结束。染色单体的分开常从着丝点处开始，然后两个染色单体的臂逐渐分开。当它们完全分开后就向相对的两极移动。

5、末期是指从子染色体到达两极开始至形成两个子细胞为止的时期。此期的主要过程是子核的形成和细胞体的分裂。

子核的形成大体上是经历一个与前期相反的过程。到达两极的子染色体首先解螺旋而轮廓消失，全部子染色体构成一个大染色质块，在其周围集合核膜成分，融合而形成子核的核膜，随着子细胞核的重新组成，核内出现核仁。核仁的形成与特定染色体上的核仁组织区的活动有关。

(6)细胞周期研究方法扩展阅读：

分裂具有周期性，即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，从形成子细胞开始到再一次形成子细胞结束（下图）为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期。

分裂间期分G1、S和G2期，分裂间期为分裂期进行活跃的物质准备，完成DNA分子的复制和有关蛋白质的合成。

同时细胞有适度的生长（这两个阶段所占的时启樱间相差较大，一般分裂间期大约占细胞周期的90%-95%；分裂期大约占细胞周期的5%-10%。细胞种类不同，一个细胞周期的时间也不相同。）

分裂期又分为分裂前期、分裂中期、分裂后期和分裂末期。细胞在分裂之前，必须进行一定的物质准备。细胞增殖包括物质准备和细胞分裂整个过程。有丝分裂是一个连续的过程按先后顺序划分为间期、前期、中期、后期和末期五个时期，在前期和中期之间有时还划分出一个前中期。

与有丝分裂有关的细胞器

中心体——与纺锤体的形成有关；

线粒体——与提供能量有关 ；

高尔基体——与植物新形成的细胞壁有关；

核糖体——与全过程清脊需要的蛋白质合成有关，主要与间期进行的DNA复制需要的蛋白质有关；

纺锤体——纺锤体是产生于细胞分裂前初期到末期的一个特殊细胞器。

纺锤体的形成

由微管蛋白聚合成纺锤体微管的过程。微管蛋白的聚合有两种基本形式：一种是自我装配型，另一种是位点起始装配型，后者有特殊位点做为聚合的起始部位，前者没有这种特殊位点。

形成纺锤体时的位点统称为“微管组织中心”(MTOC)。中心体和着丝点都是MTOC，它们在离体情况下都能表现出使微管蛋白聚合成微管的能力。纺锤体的形成显然和这些MTOC的活动是分不开的。

参考资料来源：网络-有丝分裂

⑺ 细胞周期是如何调控的

细胞周期运档简族转的调控研究中，细胞周期蛋白（cyclin）家族和周期蛋白依赖激酶（cdk）家族发挥了重要作用。
cdks和cyclins结合形成异源二聚行弊体的复合物，具有蛋白激酶活性。cdk是催化亚基，cyclin是调节亚基。只有与相应的cyclin结合后，在一些蛋白激酶和磷酸酶参与下经过磷酸化和去磷酸化作用，cdk才能表现出激酶活性。cdk-cyclin复合物可参与磷酸化多种咐如蛋白、调节与dna复制和有丝分裂等有关的分子事件。
希望能帮到那你！

⑻ 探究细胞周期实验的要点

细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。
生命是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂， 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志，细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细答改胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。
（一） 间期

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）清弯判与DNA合成后期（G2期）。

1. G1期（first gap）从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显着增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。细胞进入G1期后，并不是毫无例外地都进入下一期继续增殖，在此时可能会出现三种不同前景的细胞：①增殖细胞：这种细胞能及时从G1期进入S期，并保持旺盛的分裂能力。例如消化道上皮细胞及骨髓细胞等；②暂不增殖细胞或休止细胞：这类细胞进入G1期后不立即转入S期，在需要时，如损伤、手术等，才进入S期继续增殖。例如肝细胞及肾小管上皮细胞等；③不增殖细胞：此种细胞进入G1期后，失去分裂能力，终身处于G1期，最后通过分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神经细胞、肌细胞及成熟的红细胞等。

2. S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。

3. G2期（second gap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。

（二）分裂期

M期：细胞分裂期。

细胞分裂期：前期，中期，后期，末期。

细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

1. 前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

2. 中期（metaphase）细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个，其中44个为常染色体，2个为性染色体。男性的染色体组型为44+XY，女性为44+XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹闹悄状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

3．后期（anaphase）由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑 铃形。

4．末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；细胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

G0期：暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期。

在体内根据细胞的分裂能力可把它们[1]分为三类：①周期性细胞，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环；②终端分化细胞，如成熟的红细胞、神经细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）；③暂不增殖细胞群（G0期细胞），如肝细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。

周期作用折叠编辑本段
目前，科学家已发现有几类调控因子在细胞周期中起着重要作用。一类是对细胞分裂增殖有调控作用的细胞生长因子。如第二类细胞周期调控因子，又称内源性调节因子，是细胞内自己合成的蛋白质。

细胞周期调控机制的序幕已经拉开，科学家们正在从不同的角度研究细胞周期与癌基因、抑癌基因、生长因子以及细胞增殖分化的关系，相信通过努力，我们最终能找到控制细胞周期的神奇“开关”。在肿瘤治疗中我们也可利用细胞周期的原理对症下药。如G0细胞对化疗不敏感，往往成为日后癌症复发的根源。因而可以设法诱导G0期癌细胞进入增殖周期再行杀灭。这是一个尚在探索中具有理论意义和实践意义的问题。

相关检测折叠编辑本段
Ⅰ、样品准备准备以下一种或几种样品

A、组织单细胞悬浮液（如淋巴腺、脾、骨髓、胎盘细胞）
B、组织培养细胞

C、Ficoll-hypaque分离的单核细胞

Ⅱ、反应体系－DNA低渗缓冲液

柠檬酸三钠 0.25g

Triton-X 100 0.75ml

Propidium iodide 0.025g

核糖核酸酶0.005g

蒸馏水250ml

我们将该DNA低渗溶液于密闭瓶子中存放数月后并无发现有任何染色活性的丢失

Ⅲ、染色

1、 每一个管子中放入1×106个细胞；

2、 样品离心后尽可能完全地移去上清液，并且不要打碎沉淀块；

3、 入1ml的DNA低渗染色（可用甲基绿进行染色）缓冲液至沉淀中，并混匀；

4、 样品于4℃下避光30分钟或最长不超过1个小时以备流式细胞仪分析。

注意：延长在低渗缓冲液的曝光时间会引起样品碎片的增加。细胞周期检测可以作为生物相容性评价指标，示例如下：应用体外细胞培养法，观察不同质量分数羟基磷灰石浸提液对L-929细胞的细胞学形态的影响，同时采用MTT比色法评价羟基磷灰石对L-929生长和增殖的影响，流式细胞仪检测羟基磷灰石浸提液对L-929细胞生长周期及凋亡的影响。结果表明，羟基磷灰石浸提液对体外培养的细胞形态无明显影响，对细胞生长和增殖无明显抑制作用；不同质量分数材料浸提液的细胞毒性为 0~1级，随羟基磷灰石浸提液质量分数的升高，细胞凋亡率逐渐上升；50%、75%、100%羟基磷灰石浸提液组能明显降低G0 /G1 期细胞比例，增加S,G2 /M期细胞比例，能增加L-929细胞DNA的合成，促进细胞生长和组织修复。细胞周期检测是生物材料生物相容性评价的一种可靠方法和指标。

其他资料折叠编辑本段
细胞周期（细胞有丝分裂）口诀 折叠

以植物细胞有丝分裂为例：

有丝分裂分五段

间前中后末相连

间期首先作准备

间期染体复制在其间

前期 两消两现一散乱

中期 着丝点聚赤道板

后期 丝牵染体两极走

末期 两消两现壁重建

注：动物细胞末期不生成细胞壁。

周期详解 折叠

以有丝分裂方式增殖的细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程。这一过程周而复始。细胞周期是50年代细胞学上重大发现之一。在这之前认为有丝分裂期是细胞增殖周期中的主要阶段，而把处于分裂间期的细胞视为细胞的静止阶段。1951 年霍华德等用P-磷酸盐标记了蚕豆根尖细胞，通过放射自显影研究根尖细胞DNA合成的时间间隔，观察到P之掺入不是在有丝分裂期，而是在有丝分裂前的间期中的一段时间内。发现间期内有一个DNA合成期（S期），P只在这时才掺入到DNA;S期和分裂期（M期）之间有一个间隙无P掺入，称为G2期，在M期和S期之间有另一个间隙称为G1期，G1期也不能合成DNA。

于是他们提出了细胞周期的概念，并首先证明间期是细胞周期中极为重要的一个阶段，发生着许多与细胞分裂有关的特殊生化事件。这一发现被以后学者们用H-胸腺嘧啶核苷进行的类似研究所证实。

细胞生命活动大部分时间是在间期度过的，如大鼠角膜上皮细胞的细胞周期内,间期占14000分钟。分裂期仅占70分钟。细胞周期各阶段都有复杂的生化变化。间期是细胞合成DNA、RNA、蛋白质和各种酶的时期，是为细胞分裂准备物质基础的主要阶段。

在一个增殖的细胞群中，所有细胞并非是同步增殖的，它们在细胞周期运行中，可能有四种命运（图1）：①细胞经M期又开始第二次周期；②停止于G2期，称为G2期细胞（R2），它受某种刺激后可进入周期；③停止在G1期，称为休止细胞或名G0期细胞，这类细胞受某种刺激仍能进入周期，并开始DNA合成和有丝分裂；④丧失生命力近于死亡的细胞，称为丢失细胞，或称不再分裂的细胞。继续分裂的细胞沿着细胞周期从一个有丝分裂期到下一个分裂期。不再分裂的细胞离开了细胞周期不再分裂，最终死亡。

G1期 进行大量物质合成时期。细胞体积逐渐增大，制造RNA（包括tRNA，mRNA，rRNA以及核糖体等）。RNA的合成又导致结构蛋白和酶蛋白的形成，这些酶又控制着形成新细胞成分的代谢活动。G1又分为G1早期和G1晚期两个阶段；细胞在G1早期中合成各种在G1期内所特有的RNA和蛋白质，而在G1晚期至S期则转为合成DNA复制所需要的若干前体物和酶分子，包括胸腺嘧啶激酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶等，特别是DNA聚合酶急剧增高。这些酶活性的增高对于充分利用核酸底物在S期合成DNA是不可少的条件。

G1期持续时间变异很大，多数细胞的G1期较长，是与细胞需要增加质量有关。但在某些单细胞生物如大变形虫、四膜虫和多细胞生物的某些细胞（如海胆胚胎，小鼠胚胎细胞）则无G1期，中国仓鼠卵巢细胞的变异株无G1和G2期，以致M期和S期连接在一起。G1期的长短之所以变化很大，与G1期内存在一个校正点或阻止点（简称R点）有关。R点主要控制 G1期时间的长短。通过了此点，细胞就能以正常速度不受外界条件的影响而完成细胞周期的其他时期。因此，有人认为细胞的生长是在G1期R点上停止的，例如当细胞内环腺苷酸（cAMP）水平增高，细胞密度增加时，可阻止细胞从G1期向S期过渡，用嘌呤霉素抑制蛋白质合成或用放射线菌素D抑制RNA合成，也能延缓细胞从G1期进入S期。有人发现 G1期内能合成一种有触发作用的蛋白质；它是不稳定的，极易被分解，故称为v蛋白。v蛋白在G1细胞中达到一定水平时，细胞便可通过R点进入S期。

G0期 细胞周期的调节主要是通过G1期的阻留而实现的，G0期即指细胞处于阻留的状态。细胞通过M期一分为二，有的可继续分裂进行周期循环，有的转入G0期。G0期是脱离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段。但在一定适宜刺激下，又可进入周期（图1），合成DNA与分裂。G0期的特点为：①在未受刺激的G0细胞，DNA合成与细胞分裂的潜力仍然存在;②当G0细胞受到刺激而增殖时，又能合成DNA和进行细胞分裂。

S期 在这一阶段完成DNA的合成以及合成与DNA组装构成染色质等有关的组蛋白。DNA含量在此时期增加一倍。S期终结时，每一染色体复制成两个染色单体（Hole,1979）。生成的两个子代DNA分子与原来DNA分子的结构完全相同。一个人体细胞核直径10～20微米，其中DNA含量为10克，如拉成一根DNA链，长度可达3米。哺乳类动物细胞S期一般为6～8小时。DNA的复制能在几小时内完成，主要是由于DNA链分成许多的复制单位（复制子）（可多达10000个左右），它们可在S期的不同时间分别复制。另外，在S期内还有组蛋白的合成──组蛋白基因在G1-S期之间活化，组蛋白mRNA的转录增大，并在整个S期内连续进行。已合成的组蛋白使新合成的DNA很快转为核组蛋白复合体。

S期细胞含有一种因素能诱导DNA合成，用细胞融合实验证明，G1细胞在与S期细胞融合后能加速其核内DNA复制的起点启动。S期不同阶段复制的DNA碱基组成是不同的，早期复制的DNA富有G-C碱基，晚期复制的DNA富有A-T碱基，即常染色质比异染色质复制较早（图2）。

G2期 是DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙，在这期间细胞合成某些蛋白质和RNA分子，为进入有丝分裂提供物质条件。用放射标记的RNA前体和蛋白质前体示踪，表明G2期进行着强烈的RNA和蛋白质的合成。假如破坏这些合成过程，细胞就不能过渡到M期。G2期合成的是染色体浓缩以及形成有丝分裂器所需的成分。有人认为G2期继续完成从S期就开始的微管蛋白的合成，为M期纺锤丝的组装提供原料。在G2晚期开始合成有丝分裂因子。在某些缺少G1期细胞中，G2期更为复杂，还要担负起其他细胞G1期中所要完成的事件。也有少数情况，S期结束后立即开始有丝分裂，而不存在G2期。

M期 有丝分裂时期，是细胞形态结构发生急速变化的时期，包括一系列核的变化、染色质的浓缩、纺锤体的出现，以及染色体精确均等地分配到两个子细胞中的过程，使分裂后的细胞保持遗传上的一致性。M期分为前期、中期、后期和末期（见有丝分裂）。M期虽是形态变化最为显着的时期，但其呼吸作用反而降低，蛋白质合成明显下降，RNA合成及其他代谢周转停止，这是由于有丝分裂期所需要的能量和其他基本物质均在间期内合成和贮备好了有关。

细胞周期中，细胞形态也发生一系列变化，从光学显微镜下可看到G1期细胞最小，细胞扁平而光滑，随着向S→G2→M期的发展细胞逐渐增大，从扁平变成球形。扫描电镜下可明显看到各时期内细胞表面形态的变化，如微绒毛逐渐增加，这些变化和细胞内各种生化的和生理的周期性变化是有关的。

调控细胞周期中的许多生化事件是按一定顺序，有条不紊地进行着，这和基因按一定顺序表达密切相关。

有人认为，细胞周期内有两个阶段最为重要：G1到S和G2到M；这两个阶段正处在复杂活跃的分子水平变化的时期，容易受环境条件的影响，如果能够人为的进行调控，将对深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。

已发现很多体内因素可以激发或抑制细胞的增殖，例如多种激素、血清因子、多胺、蛋白水解酶、神经氨酶、cAMP、cGMP以及甘油二脂（DG）、 三磷酸肌醇（1P3）和Ca信使系统等等。细胞内cAMP浓度增加对细胞增殖有抑制作用，凡能使细胞内cAMP增高的因素都能抑制细胞的增殖，降低细胞生长速度；反之，凡能使细胞内cAMP含量下降的因素都能促进DNA的合成与细胞的增殖。细胞周期的各期中的cAMP含量也不相同（见表）。在中国仓鼠卵巢细胞株中，M期cAMP含量最低，M期后cAMP的水平增高三倍，从G1早期至G1晚期，cAMP水平降低到中等水平，直至S期仍维持低的水平（图3）。

还有许多实验指出cGMP 也对细胞增殖起调控作用，如将cGMP或双丁酰cGMP加到休止在G1期的 3T3 细胞时，能诱导DNA含量的增加， 促进细胞的分裂。如提高细胞cGMP水平，就可促进细胞的有丝分裂，反过来，促进有丝分裂的药物也能增加cGMP的浓度。

cAMP能抑制细胞的分裂，促进细胞的分化，cGMP则能抑制细胞分化，促进细胞增殖，在正常生长的细胞中，cAMP和cGMP维持在适当的水平，调节控制细胞周期的运转。

抑素是细胞产生的一种小分子蛋白质或多肽，有的还含有糖或RNA。它无种属特异性，但有细胞特异性，对同类细胞增殖有抑制作用并且可逆。当抑素含量达到一定浓度时可抑制同类细胞的增殖，抑素浓度下降则细胞增殖活跃。有人认为抑素作用的机制，在于它能激活细胞膜上的腺苷环化酶活性，提高细胞内cAMP的浓度，因而抑制细胞的增殖，也可能通过cAMP-依赖性蛋白激酶对蛋白质的磷酸化作用来影响调节基因的活动。

细胞周期也受机体调节系统的影响，例如肝再生就是由调节系统的作用加速肝细胞增殖。但是肿瘤细胞，由于宿主失去对它的调控，因而恶性增殖。在肿瘤治疗中可应用细胞周期的原理，如G0期细胞对化疗不敏感，往往成为日后癌症复发的根源，因而可通过调控机理的研究，诱发G0期癌细胞进入细胞周期，再合理用抗癌药物加以杀灭，是防止癌转移和扩散的重要调控措施，也是细胞动力学中有理论意义和实践意义的研究问题。

总之，目前所了解的细胞增殖调控的分子基础还少，尚待进一步探索。

细菌DNA增值特点 折叠

细菌DNA复制、RNA转录和蛋白质合成同时进行，这是细菌对快速生长的适应。

DNA复制不受细胞周期的限制，快速生长的细菌，在上一次细胞分裂结束时，细胞内的DNA经复制到一半进程，以保证迅速进行下一次分裂。

⑼ 手把手带你迈过“细胞周期”流式检测的门槛

开始讲周期检测前先带大家回忆一下细胞周期的基本知识（高手可自行跳过）。

细胞周期(cell cycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为分裂间期(interphase)和有丝分裂期(mitosis)两个阶段。

分裂间期分为三个连续的阶段：第一阶段称为 G1期，细胞对环境进行“裤迅监测"，当接收到必要的信号后，细胞便开始合成 RNA和蛋白质来诱导细胞生长；一旦条件合适细胞便进入S期，开始合成 DNA和复制其染色体 DNA，使体细胞成为4倍体，与此同时还合成组蛋白，进行中心粒复制，S期一般需几个小时；最后在 G2期细胞持续生长并准备进行有丝分裂，中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等，G2期比较恒定，需用1～1.5小时。

有丝分裂需经前期(prophase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

此外还有G0期，G0期是细胞暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期。

我们之所以能够对细胞周期进行检测主要就是根据周期不同阶段细胞DNA含量不同的原理进行检测，此外这个过程中一些蛋白的表达水平也会发生变化，亦可以成为周期检测的辅助手段。

检测周期最简单、最基本的方法就是利用DNA染料，如PI、7-AAD等（各染料特征见文末附表）对细胞进行染色，DNA含量多则荧光强度高，DNA含量低则荧光强度低，根据荧光强度的变化就可判断细胞处在周期的哪个阶段。理想状态下，如果G0/G1期细胞的荧光强度为N，则S期细胞的荧光强度处于N～2N之间，G2/M期细胞的荧光强度为2N，如图示：猜腊

但实际情况则如下图所示：

实际的图形中各期的细胞和理想情况相比都具有一定的宽度，这是由于细胞染色和激光照射不完全均一等原因所致，通常用变异系数(CV)来衡量，一般来讲CV值应该小于3%。这就带来了一个问题，图中红色圆圈部位的细胞到底处于哪个周期？解决方法是计算机上的周期分析软件可以利用数学模型通过一定的算法对结果进行分析，从而估算出各阶段的细胞比例。

下图为BD公司的Modfit软件分析得到的结果：

如果上述方法得到的结果已经能够满足你的需要，请点击返回键退出阅读。但如果你有追求完美的处女座性格，并不满意计算机通过数学模型估算出的结果，请继续阅读周期检测的“进阶方法”。

进阶方法--双参数检测周期

为了克服单参数法不能真实的反映出周期不同阶段细胞的比例这种困境，BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)，一种胸腺嘧啶核苷类似物，被引入了周期的检测方法中。BrdU能够在DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶(T)，进入正在复制的DNA中，而后利用抗BrdU抗体便可对其进行检测，这样便可明确将S期细胞与G0/G1期细胞和G2/M期细胞进行区分。

但BrdU需要变性DNA后才能与抗体结合，破坏了DNA双链结构，影响了Hochest等染色，导致染色弥散，准确性降低等问题，逐渐被EdU取代。EdU是另外一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤。

看似问题已经得到了解决，那么关于细胞周期检测我们还能做得穗纯滑更好吗？

答案是肯定的。因为上述方法都不能对G0期和G1期的细胞进行区分，亦不能对G2期和M期的细胞进行区分。为了实现这个目标Christine Vignon等人发明了一种三参数双荧光的检测方案。除了常规的DNA染料7-AAD，研究人员引入了Ki-67和磷酸化组蛋白H3这两个指标，Ki-67在G0期不表达可以用来区分出G0期细胞，Ser10磷酸化的组蛋白H3与染色体凝缩高度相关可用来区分出处于M期的细胞。详情请见图：

上述方法基本上可以满足大部分研究者对于周期研究的需求，至于对周期更极致的区分已经超出了我的能力范畴，就不再献丑了。

双参数法都可以怎么玩？

双参数法虽然对周期的区分不如三参数法细致，但根据不同的实验目的还是能够玩出一些不一样的感觉。

如果你想知道在给定时间里有多少个细胞处于周期循环中，您可以将细胞暴露于BrdU下较短的时间(如30分钟)，然后进行检测。这样你就可以比较同种细胞接受不同处理方式后周期各个阶段细胞百分比的差异，或者比较不同细胞类型间的差异。

如果你想知道培养的细胞中是否有静止的，未进入周期循环的细胞，可将细胞暴露于BrdU较长一段时间(例如24小时)后再进行检测。任何BrdU阴性的细胞都是未进入细胞周期循环的静止细胞。

如果你对细胞跨越周期不同阶段所需时间感兴趣，您可以将BrdU添加到培养液中15分钟，然后换成不含BrdU的培养液。在不同时间点取样品进行检测。追踪实验开始时BrdU阳性的处于S期的细胞，比如当你看到标记的细胞重新出现在G1期，你就知道该细胞通过G2和有丝分裂期用了多长时间。

⑽ 细胞周期测定

儿童白血病细胞DNA含量及细胞周期的临床分析
刘爱国 胡 群 陶红芳 张柳清 胡 迎
华中科技大学附属同济医院儿科(湖北 武汉) 430030
中国图书分类号 R725·2 文献标识码 B 文章编号 1001-4411 (2008) 07-0980-03
【摘 要】 目的:探讨小儿急性白血病(AL)患者骨髓细胞周期分布与分型和治疗的关系。方法:应
定96例小儿AL骨髓单个核细胞DNA含量和细胞周期。结果:不同类型的AL异倍体发生率不同,急性淋巴
异倍体率55·7% (44/79),明显高于急性非淋巴细胞白血病(ANLL)的29·41% (5/17), T-ALL异倍体
高于B-ALL (41·67% ),统计学差异均有显着意义。AL初诊病例和复发病例的G0/G1期细胞比例高于完全
G2M+S期比例低于完全缓解组和对照组(P<0·05),完全缓解组和对照组无显着差异。结论:图像分析系统
异倍体的分析,有利于判断高危ALL,对细胞周期的测定给化疗个体化提供了具体的参考指标。
【关键词】 儿童白血病 DNA含量 细胞周期 图像分析系统
C linical implication ofDNA content assay and cell cycle distribution in
cute leukem ia
LIUAi-Guo, HU Qun, TAO Hong-Fang et al·Department ofPediatrics, TongjiHospital, HUST,
China
〔Abstract〕 Objective:To investigate the distribution ofmarrow cell cycle and the relationshipwith the types o
peutic effects in childhood acute leukemia (AL)·M ethods:Mononuclear cellularDNA contents in bonemarrowwere
nalysis system in 96 patientswith childhoodAL·Results:The proportion ofpatientswith DNA-aneuploidwas differen
ofAL: DNA-aneuploid in the patientswithALLwas 55·7% (44/79), much higher than that in the children withA
17)·Statistically significantdifferenceswere found between the T-ALL group and B-ALL group in the DNA- aneu
vs 41·67%,P<0·05)·The leukemia cell cycle distribution indicated thatG0/G1-phase compartment in untreate
group were higher than in complete remission group and normal controls, G2M+S-phase compartmentwere lower tha
sion group and normal controls (P<0·05)·There were no significant differences in cell cycle distribution between
group and normal controls·Conclusion:The analysis ofAL, especiallyALL aneuploid, by image analysis system can
guishing the high riskALL from the standard riskALL, and the determination of cell cycle distribution can provide a c
for chemotherapy·
〔Key words〕 Childhood leukemia; DNA content; Cell cycle; Image analysis system
细胞DNA含量及细胞周期的变化与白血病发生、发展及
转归有密切的关系。快速分析白血病细胞的动力学变化,可
以评估其增殖能力,初步判断化疗的疗效。研究白血病细胞
的DNA指数和细胞周期的变化,对协助临床诊断和制定个体
化的化疗方案有着重要意义。经典的细胞周期分析方法为流
式细胞仪,但仪器和试剂昂贵限制了其在临床的广泛应用。
笔者采用图像分析系统检测不同病程的儿童白血病细胞DNA
指数、倍体的改变和细胞周期的变化,以及这种变化与临床
的关系,报道如下。
1 资料与方法
1·1 对象及分组 2003年4月~2005年8月儿科血液病房
住院急性白血病(AL) 96例,,男60例,女36例,年龄8个
月~14岁,平均7·1岁。其中急性淋巴细胞白血病(ALL )
79例(初治31例,复发/难治5例,完全缓解43例),急性
非淋巴细胞白血病(ANLL) 17例(初治8例,复发/难治4
例,完全缓解5例)。所有病例均经细胞学及免疫学检查确
诊。
1·2 方法 分别选取不同病程的白血病患儿及正常对照组骨
髓穿刺涂片标本,空气中干燥至少1 h,多聚甲醛固定30 min,
然后进行Feulgen染色〔1〕。采用CMIAS-B图像分析系统测定
细胞核DNA相对含量及DNA指数(DI),同时分析不同细胞
周期的细胞所占百分比。
1·3 DNA倍体判断标准 根据DI判断, DI系样本的G0/G1
期细胞与正常二倍体G0/G1期细胞荧光强度之比。DI正常范
围为0·9~1·1, DI<0·9为亚二倍体, DI>1·1为超二倍体,
亚二倍体和超二倍体均为异倍体。
1·4 统计学方法 应用SPSS 8·0软件,进行χ2检验和t检
验。
2 结果
2·1 DNA异倍体检出情况 79例ALL检出DNA-异倍体
44例,异倍体率55·7%其中48例B-ALL检出异倍体20
例,异倍体率41·67%, 31例T-ALL检出异倍体24例,异
倍体率77·42% ,两个不同免疫类型ALL出现异倍体的阳性
率有显着差异(χ2=9·76, P<0·05)。检出的5例亚二倍体
中,全部为T-ALL。17例ANLL检出异倍体5例,异倍体率
29·41%,与ALL组比较有显着性差异(χ2= 3·84, P<
0·05)。见表1。对照组10例无异倍体检出。
2·2 细胞周期分布 AL初治组患儿的G0/G1(% )明显高
于完全缓解组(t=2·83,P<0·05)和
P<0·05), S+G2/M (% )则明显低于
2·06,P<0·05)和对照组(t=2·74,P<
复发/难治组差异无显着意义(t分别为1·
0·05)。进一步分析ALL组和ANLL组,各
着差异性。见表2。
表1 AL异倍体检出率(
组别初诊缓解
ALL 58·06 (18 /31) 48·84 (21 /43)
B-ALL 55·00 (11 /20) 26·92 (7 /26)
T-ALL 90·91 (10 /11) 64·71 (11 /17)
ANLL 25·00 (2 /8) 20·00 (1 /5)
表2 AL不同病情细胞周期
组别nG0/G1S G
初诊39 89·8±5·3 9·4±8·9 2·7
完全缓解48 72·9±6·5 19·1±10·1 7·4
复发/难治9 83·5±7·1 8·3±5·3 9·4
对照10 70·4±5·4 22·1±4·5 7·3
3 讨论
DNA异倍体是肿瘤的特异性标志已为
体改变在白血病中很常见,国内外均有报
体检出率约为50%〔1〕,本试验79例AL异
与文献报道相符,其中T-ALL异倍体检出
二倍体集中出现于T-ALL中,而B-ALL
41·67% ,明显低于T-ALL。从诊断AL
T-ALL、亚二倍体均作为高危因素,由此
不好与异倍体的出现特别是亚二倍体有关〔
检出率明显高于ANLL组,从遗传学角度
制,表明ANLL患儿的染色体异常较多地
而不是数目异常,这可能是临床ANLL较
因之一〔2〕。
ALL初诊组及难治/复发组DNA异倍
其中难治/复发组与CR组的差异更为显着,
义。随着患者的完全缓解, DNA异倍体率
有部分CR患者存在DNA异倍体。故此类
师重视,以最大限度地延长患者长期生存率
文献记载,白血病细胞的细胞周期比
处于S期和G2M +S期的细胞比例比正
刘爱国等 儿童白血病细胞DNA含量及细胞周期的临床分析 第7期
G2M+S期比例代表该细胞群体中增殖细胞的数量,从另一侧
面反映细胞的增殖状态。本实验显示, AL组患儿骨髓细胞的
G0/G1(% )明显高于缓解组和正常对照组,而S%及S+
G2/M (% )明显低于缓解组和对照组,说明了白血病骨髓细
胞从G0/G1期至S期之间存在运行阻滞,表明白血病骨髓细
胞的增殖能力低于正常。亚二倍体ALL患儿的骨髓细胞增殖
能力低,故预后相对较差。而超二倍体骨髓细胞的增殖分化
需要复制合成更多的遗传物质, S期相对延长,进入S期的细
胞增多,因而临床上对于超二倍体的ALL患儿,联合使用作
用于S期白血病细胞的药物,能达到更佳的治疗效果〔3〕。
故我们认为,在评定AL患者危险度和制定化疗方案时,
除可以MDR作为依据外,患者DNA指数及DNA异倍体率以
及细胞周期分析均可作为重要参考指标。
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