tf的无菌化处理应选用什么方法

① 在开展无菌实验之前要对无菌室进行怎样的无菌处理

综述：无链桐弯菌室的无菌处理：先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30-60分钟。检验用的有关器材， 搬入无菌室前必须分别进会灭菌消毒。

无菌试验室主要用于微生物学、生物医学、生物化学、动物实验、基因重组以及生轮罩物制品等研究使用的实验室统称洁净实验室-生物安全实验室。

特点：

凭借对用户需求的深刻理解，精湛的咨询顾问和工程设计施工方面的专家队伍，先进的规划运营理念和与国际着名品牌供应商的良好合作关系，形成了一套完善的洁净实验室-生物安全实验室解决方案。它具有高安全性、专业化、整体性、模块化、标准化等特点。

参考资料来源：网络棚闷网络－无菌试验室

② 请问，实验室做完微生物后的培养基可以高温煮沸然后倒掉吗，有菌和无菌的。

微生物的实验室培养：

1．培养基的概念、种类及营养构成
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。

(3)营养构成：各种培养基一败让般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2．无菌技术
(1)关键：防止外来杂菌的入侵。
(2)具体操作
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(3)消毒和灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化差滑学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
4、接种方法：平板划线法和稀释涂布法。
（1）平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续虚枯腊的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是：稀释涂布平板法。

③ 无菌室需定期用什么消毒溶液擦拭墙，地面，桌椅及其它设施

可使用百分之九十五酒精溶液， 以及每2—3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液喷雾消毒空气，最后紫外灯杀菌半小时。

无菌室不同的对象采用不同的处理方法

1、高压蒸汽灭菌: 工作服、口罩、稀释液等，置高压杀菌锅内，一般采用121℃灭菌半小时,当然不同的培养基有不同的要求,应分别处理

2、火焰灭菌：接种针、接种环等可直接火焰灭菌

3、 高温干燥灭菌： 各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置吵慎于燥箱中160℃灭菌2小时

4、 一 般消毒: 无菌室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法进行灭菌，必须用其他备碰迹方法进行消毒处理，采用2%石炭酸或来苏儿水溶液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒

5、空气的消毒： 开启紫外灯照射30—60分钟 即可。

(3)tf的无菌化处理应选用什么方法扩展阅读：

无菌室建造条件

1、无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。

2、严防一切灭菌器材和培养基污染，已污染者应停止使用。

3、无菌室应备有工作浓度的消毒液，如5%的甲酚溶液，70%的酒精，0.1%的新洁尔灭仿并溶液，等等。

4、无菌室应定期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求。

5、需要带入无菌室使用的仪器，器械，平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。

④ 怎么让淀粉溶液无菌

可以高压灭菌，但淀粉也会糊化，变成透明液体。

⑤ 无菌操作的原则是什么

无菌技术的操作原则如下：
1、首先要在相对无菌的环境中进行无菌操作。
2、操作者一定要带好口罩、帽子，穿好无菌衣，然后带好无菌手套，这时可以接触无菌物品，然后使用无菌物品进行无菌操作，在无菌操作时千万不能触碰有菌物质，一旦触碰，则立即停止无菌操作，避免细菌感染的情况。所以无菌技术的基本操作原则是严格进行无菌操作，在操作的过程中不能触碰有菌物，否则操作失败。

⑥ 无菌检验方法验证

无菌检查 方法 是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随我一起来了解下吧！

无菌检验方法验证

无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。

前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。

再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。

通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。

前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。

供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。

(一)具体的验证方法如下：

1. 菌种的选择

无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 [CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌 [CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌 [CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。

2. 菌液的制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28 ℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

3. 样品的前处理

无菌产品中每个成分应该是均匀的，因此只要确定在验证的方法中，按所需的总接种量即可，而不必像样品日常检测中按规定的容器数取样。

如果制备样品时需要使用溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等溶剂，需要确保这些溶剂是有效的，并且其使用对微生物生长无影响;或者制备过程中需要对样品进行加热助溶、离心等操作时，需要确保加热的温度、离心速度和离心时间等对微生物生长或分布无影响。 不需前处理的样品免做。

(二)消除样品抑菌性的方法

无抑菌性样品的验证方法：依据产品溶解性和微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释，用直接接种法验证，常用中性稀释液或淋洗液。

对于具有抑菌性样品的验证方法，首先确定样品的抑菌作用(抑细菌、真菌试验验证)，选择敏感标准菌株对供试品抑菌活性去除效果检查(阳性菌回收试验)。 常用的消除样品抑菌活性的方法如下：

1. 稀释法：利用降低供试品的相对浓度，将样品稀释至最低抑菌浓度下进行。如：取规定量的样品溶液至较大量的培养基中，使单位体积内的样品含量减少，至不含抑菌作用。

2. 薄膜过滤法：利用体积差异分离，通过薄膜过滤，微生物被截于滤膜，培养薄膜观察有无微生物生长。通常薄膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50?mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。滤器和滤膜在使用前采用适宜的方法进行灭菌。使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 供试液经过滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100?ml。总冲洗量不得超过1000ml。

3. 化学中和法：利用化学(生物)专属性灭活，常用中和剂或灭活方法有：对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。对化学中和剂不敏感的样品，用酶中和，如β -内酰胺酶。

4. 联合使用：将以上两种或几种方法组合运用，以消除样品的抑菌性。适用于抑菌作用较强的中西药制剂。

5. 其次按照以下要求制备3组样品：

样品组：选择以上适当的方法中和样品，加入少量验证微生物(接种量少于100cfu)。

对照组：0.1%蛋白胨或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,加少量微生物(接种量少于100cfu)。

阳性对照组：将试验菌株直接接种于培养基中(接种量少于100cfu)。

6. 最后结果分析如下：

样品组与对照组微生物生长数量相似，表明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性(即有效性)，如果对照组与阳性对照组的微生物数量相似，表明样品预处理、消除样品抑菌性的方法、检测程序和培养条件等均不影响微生物生长(即无毒性)。样品如无抑菌性，省去对照组试验，样品组与阳性对照组直接比较。样品组微生物生长数量不及阳性对照组微生物生长数量，表明样品的预处理、试验用器具材料、培养条件等方面存在对微生物生长不利的因素。

(三) 为考查验证方法的稳定性和重现性，验证至少需3个不同批次的同类样品，分别进行3次验证试验。

无菌检查方法验证试验设计

薄膜过滤法：按照药典的要求取每种培养基规定接种的样品总量按薄膜过滤法过滤、冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤桶内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按照药典的要求的温度和时间进行培养。

直接接种法：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100?cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，按照药典的要求的温度和时间进行培养。

结果判断

同对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明验证通过;如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，验证失败，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂和灭活剂、更换滤膜等方法，消除供试品的抑菌作用，重新进行验证。

无菌检查的常见方法

首先要检查方法验证方案设计的科学性和完整性，是否有与药典方法相悖的地方，尤其是产品本身的抑菌性，检查方法的选择，是直接接种法还是薄膜过滤法等。

无菌检查方法验证的硬件是否具备及是否已经进行了相关的确认。如使用黑曲霉菌是否具有生物安全柜并进行确认，无菌室的确认及日常监测，培养箱的型号及数量和进行确认的情况等，智能集菌器、全封闭无菌试验过滤培养器的型号、性能，滤膜是否符合规定等。

验证中各个环节有关数据的真实性，如产品本身抑菌性试验数据，菌种回收率和培养基适用性和灵敏度检查数据，菌种的传代、销毁和使用记录，无菌检查操作记录、培养记录等。

无菌检查中偏差的处理是否真的找到了根本原因，是否在没有确切的原因前就对样品重新检查并依据新的检查结果放行产品。

验证的方法与无菌检查操作规程和无菌检查记录是否完全一致，如操作步骤、检查方法、检查环境、试验耗材均需与实际检查操作规程及验证过程完全相符。

为了考查验证方法的稳定性和重现性，验证时是否至少采用了3个不同批次的同类样品，分别进行了3次验证试验。

使用新的滤膜或过滤器(不同厂家或批号、型号)是否重新进行样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组的验证确认。

除非样品不能采用过滤的方法(难溶解)，企业是否采用全封闭的薄膜过滤法。

菌液的保存条件和保存期限是否符合药典的要求，对于黑曲霉孢子悬液是否有验证的资料。

无菌检查的注意事项

培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查。

中国药典附录中规定的检验数量不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略。

无菌检查时应强调“检验数量”，主要是保证试验结果的代表性，而阳性对照试验和验证时仅须满足“检验量”总量要求即可，以保证试验结果的可靠性，验证试验可以由此减少大量的样品;工作菌株的传代次数不得超过5代，以防止过度的传代增加菌种变异的风险。这里“代”的定义是指，活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。

菌液加入，按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑过滤器的有效性。过滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查(如检查阳性菌液通过滤筒的流出液)。

实验室菌种的处理和保存的程序应标准化，以尽可能减少菌种污染和变异。

试验时菌悬液并不是只要活的菌体就行，而是要保持旺盛的生命力，所以菌悬液存放时间不能太长。

菌液制备后若在室温下放置，应在2?h内使用，若保存在2～8℃，可在24?h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

薄膜过滤法采用大样品量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作相对简单。该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性微生物的污染，对试验结果的可信性影响较小。因此无菌试验采用薄膜过滤法还是直接接种法并不依赖于验证结果，而是取决于样品的特性，如能采用过滤的方法均应采用薄膜过滤法检查。

若样品含有抑菌成分，当采用薄膜过滤法时，应先将供试液稀释后在过滤，这样可以减少滤膜对样品的吸附，减少冲洗量，进而减少微生物的损失或伤害。

无菌检查应作为稳定性考察的项目进行，以便对产品有效期的制定和合理的确定储存条件提供重要的依据。

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⑦ 无菌技术的常用灭菌方法

热灭菌法
热灭菌法利用高温使微生物细胞内的一切蛋白质变性，酶活性消失，致使细胞死亡。通常有干热、湿热和间歇加热灭菌等法。
干热灭菌
直接利用火焰将微生物烧死（如烧接种环、载玻片和试管口等）。不能用火焰灭菌的物品则利用热空气灭菌,将物品放在烘箱中加热到160～170℃,持续90分钟，此法适用于玻璃、金属和木质的器皿。
湿热灭菌
以沸水、蒸气和蒸气加压灭菌。巴氏灭菌法就是湿热灭菌，此法有两种方式，①低温长时间处理：在61.7～62.8℃下处理30分钟；②高温短时间处理：在71.6℃或略高温度下处理15分钟。在上述诸法中，以蒸气加压灭菌效果最好，可用常压蒸气灭菌，也可在高压蒸气锅中（一般使用1千克/厘米2）灭菌,其蒸气温度可达121℃,能将耐热的芽孢在30分钟内全部杀死。但对某些易被高压破坏的物质，如某些糖或有机含氮化合物，宜在0.6千克/厘米2压力下(110℃)灭菌15～30分钟。
间歇灭菌
间歇灭菌连续3天,每天进行一次蒸气灭菌的方法。此法适用于不能耐 100℃以上温度的物质和一些糖类或蛋白质类物质。一般是在正常大气压下用蒸气灭菌 1小时。灭菌温度不超过100℃,不致造成糖类等物质的破坏，而可将间歇培养期间萌发的孢子杀死，从而达到彻底灭菌的目的。
辐射灭菌
辐射灭菌在一定条件下利用射线进行灭菌的方法。较常用的有紫外线，其他还有电离辐射（射线加快中子等）。波长在25000～80000纳米之间的激光也有强烈的杀菌能力,以波长26500纳米最有效。辐射灭菌法仅限于某一定材料，因所需设备复杂，难于广泛使用。
渗透压灭菌
渗透压灭菌利用高渗透压溶液进行灭菌的方法。在高浓度的食盐或糖溶液中细胞因脱水而发生质壁分离，不能进行正常的新陈代谢，结果导致微生物的死亡。
化学试剂灭菌
大多数化学药剂在低浓度下起抑菌作用,高浓度下起杀菌作用。常用5％石炭酸、70％乙醇和乙二醇等。化学灭菌剂必须有挥发性，以便清除灭菌后材料上残余的药物。
实验室常用的消毒灭菌方法
一、消毒技术（一）明确消毒的主要对象 应具体分析引起感染的途径、涉及的媒介物及病原微生物的种类，有针对性地使用消毒剂。（二）采取适当的消毒方法 根据消毒对象选择简便
一、消毒技术
（一）明确消毒的主要对象
应具体分析引起感染的途径、涉及的媒介物及病原微生物的种类，有针对性地使用消毒剂。
（二）采取适当的消毒方法
根据消毒对象选择简便、有效、不损坏物品、来源丰富、价格适中的消毒方法。
医院诊疗器械按污染后可造成的危害程度和在人体接触部位不同分为三类：
1. 高度危险的器材
穿过皮肤、粘膜而进入无菌的组织或器官内部，或与破损的皮肤粘膜密切接触的器材，如手术器械、注射器、心脏起搏器等。必须选用高效消毒法（灭菌）。
2. 中度危险的器材
仅与皮肤、粘膜密切接触，而不进入无菌组织内，如内窥镜、体温计、氧气管、呼吸机及所属器械、麻醉器械等。应选用中效消毒法，杀灭除芽胞以外的各种微生物。
3. 低度危险器材和物品
不进入人体组织，不接触粘膜，仅直接或间接地与健康无损的皮肤接触，如果没有足够数量的病原微生物污染，一般并无危害，如口罩、衣被、药杯等，应选用低效消毒法或只作一般卫生处理。只要求去除一般细菌繁殖体和亲脂病毒。
（三）控制影响消毒效果的因素许多因素会影响消毒剂的作用，而且各种消毒剂对这些因素的敏感性差异很大。
1. 微生物的种类
不同类型的病原微生物对消毒剂抵抗力不同，因此，进行消毒时必须区别对待。
1）细菌繁殖体
易被消毒剂消灭，一般革蓝氏阳性细菌对消毒剂较敏感，革蓝氏阴性杆菌则常有较强的抵抗力。繁殖体对热敏感，消毒方法以热力消毒为主。
（2）细菌芽胞
芽胞对消毒因子耐力最强，杀灭细菌芽胞最可靠的方法是热力灭菌，电离辐射和环氧乙烷熏蒸法。在化学消毒剂中，戊二醛、过氧乙酸能杀灭芽胞，但可靠性不如热力灭菌法。
（3）病毒
对消毒因子的耐力因种类不同而有很大差异，亲水病毒的耐力较亲脂病毒强。
（4）真菌
对干燥、日光、紫外线以及多数化学药物耐力较强，但不耐热（60℃1小时杀灭）。
2. 微生物的数量
污染的微生物数量越多需要消毒的时间就越长，剂量越大。
3. 有机物的存在
①有机物在微生物的表面形成保护层妨碍消毒剂与微生物的接触或延迟消毒剂的作用，以致于微生物逐渐产生对药物的适应性。②有机物和消毒剂作用，形成溶解度比原来更低或杀菌作用比原来更弱的化合物。③一部分消毒剂与有机物发生了作用，则对微生物的作用浓度降低。④有机物可中和一部分消毒剂。消毒剂中重金属类、表面活化剂等受有机物影响较大，对戊二醛影响较小。
4. 温度
随着温度的升高，杀菌作用增强，但温度的变化对各种消毒剂影响不同。如甲醛、戊二醛、环氧乙烷的湿度升高1倍时，杀菌效果可增加10倍。而酚类和酒精受温度影响小。
5. PH值
从两方面影响杀菌作用。①对消毒剂的作用：改变其溶解度和分子结构。②pH过高或过低对微生物的生长均有影响。在酸性条件下，细菌表面负电荷减少，阴离子型消毒剂杀菌效果好。在碱性条件下，细菌表面负电荷增多，有利于阳离子型消毒剂发挥作用。
6. 处理剂量与监测
保证消毒、灭菌处理的剂量，加强效果监测，防止再污染。

⑧ 在化验室的无菌检查中，有没有可以替代酒精灯的

无菌室的无菌处理： 1、先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30-60分钟。 2、检验用的有关器材， 搬入无菌室前必须分别进会灭菌消毒。 3、操作人员必须将手段返洞清洗消毒，穿戴好无菌工作衣、帽和鞋，才能进入无菌室。 4、进入无菌室后再一次消毒手部，然后才进行检验操作。 5、无菌室应保持清洁整齐，室内仅存放必须的检验用具如酒精灯、酒精棉、火柴、镊子、接种针、接种环、玻璃铅笔等，不要放与检测无关的握枯物品。 6、室内检验用具及凳桌等保持固定位置，不随便移动。 7、每2-3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液喷雾消毒空气，最后紫外灯杀菌半小时。 8、定期检查室内空气无菌状况，细菌数应控制在10个以下，发现不符合要求时应立即彻底消毒灭菌。 9、无菌室杀菌前应将所有物品置于操作之部位（待检物例外），然后打开紫外灯杀菌30分钟，时间一到，关闭紫外灯待用。无菌室无菌程度的测定方法：取普通肉汤琼脂平板、改良马丁培养基平板各3个（平板直径均9厘米），置无菌室各工作位置上，开盖曝露半小时，然后倒置进行培养，测细菌总数应置37℃温箱培养48小时；测霉菌数则世伏应置27℃温箱培养5天。细菌、霉菌总数均不得超过10个。

⑨ 医疗器械的无菌操作规则

一、医院消毒灭菌效果监测：
1.必要性：
①消毒灭菌效果监测方法专业性强，不检验不知道结果；
②新建病房、新消毒设备、新消毒剂均应做效果监测。
③特殊对象、特殊需要，必做效果监测。如移植术前、ICU病房、危重病人等。
2.科学性：以科学的试验设计、熟练的技术、可靠的结果、确切地分析，得出结果评价。
3.规范性：以权威规范为依据，符合其基本原则要求。如检测时机的确定型笑圆、标准菌株的选择、标本数、重复次数、实验方法等确立。
二、监测方法的分类：
1、根据检测方法性质分：
①物理方法：测量压力灭菌温度、测量紫外线强度等；
②化学方法：各种化学指示卡；
③生物方法：嗜热/枯草芽孢灭菌效果监测自然菌存活数监测；
2、根据消毒灭菌对象性质分：
①空气消毒：
②表面消毒：
3.根据具体消毒对象分：
①压力蒸汽灭菌：
②各种器械：
③化学消毒剂：
④紫外线灯杀菌效果：
⑤手和皮肤消毒效果：
⑥空气消毒效果：
⑦物体表面消毒效果：
三、必要条件：
1、专业实验室：
2、必备设备器材：
3、选择实验方法：
4、熟练实验技术：
四、卫生部对500张床位以上医院感染管理的质量指标规定：
（1）医院感染率≤10%；灭菌切口感染 ≤0.5%
（2）医院感染的漏报率≤20%；
调查样本量不少于年监测病人数的10%
（3）医院必须对消毒、灭菌效果定期进行监测。
灭菌合格率必须达到100%
（4）使用中的消毒剂、灭菌剂应进行生物和化学监测。消毒剂每季度生物监测1次，细菌含量必须<100cfu/ml，不得检出致病微生物；灭菌剂每月检测1次，不得检出微生物。化学监测应根据消毒、灭菌剂的性能定期监测。
（5）压力蒸气灭菌进行工艺、化学和生物监测。环氧乙烷必须每锅进行工艺监测，每包进行化学监测，每月进行生物监测。压力蒸气锅每天第一锅必须做B-D试验。
（6）紫外线灯强度监测：每季度1次；新灯管30W≥90µW/cm2,旧灯管≥70µW/cm2
（7）胃肠镜等诊疗器材消毒标准不得检出致病微生物；腹腔镜、关节镜等应灭菌处理，不得检出任何微生物。
（8）进入人体组织、血液、器官的医疗用品应灭菌处理，不得检出致病微生物；接触黏膜医疗用品细菌总数≤20cfu/g（或100 cm2）；接触皮肤的医疗用品细菌总数≤200cfu/g（或100 cm2），不得检出致病微生物。
（9）母婴同室、婴儿室物体表面和医护人员手不得检出沙门氏菌。
（10）医院各类环境空气、物体表面、医护人员手细菌数标准：
环境 类 别 空气 物体表面 医护人员手
cfu/cm3 cfu/cm2 cfu/cm2
Ⅰ类 层流洁净手术室、 ≤10 ≤5 ≤5
洁净病房
Ⅱ类 普通手术室、产房、 ≤200 ≤5 ≤5
婴儿室、普通隔离病房
Ⅲ类 儿科、妇科检查室、 ≤500 ≤10 ≤10
注射、换药、治疗、
急诊、化验、普通病房
Ⅳ类 传染病科及病房 —— ≤15 ≤15
五、为保证医院消毒灭菌可靠，应认真做好医院消毒灭菌效果监测
1、影响消毒灭菌因素很多，使消毒灭菌效果难以保证。
2、消毒灭菌效果生物监测专业性强，条件难创造，结果评价难度大，实验周期长。
3、化学测试试剂法较复杂，结果准确；试纸法简便易行，但精确度较差。
六、压力蒸汽灭菌效果的监测：
（一）BD试纸：
检查灭菌器工艺状态，并不能反应灭菌器使用中被灭菌物品的实际灭菌效果。发现阳性应进行灭菌器性能检查调试。
（二）指示胶带：
表示是否经过灭菌处理，并不能反应被灭菌物品实际灭菌效果。
（三）化学指升盯示卡：
卜塌检测每包被灭菌物品的灭菌效果。建议最好每包被灭菌物品中心放一片化学指示卡,待灭菌处理后,视其变色程度（灭菌效果）决定是否使用。
（四）用生物指示剂作系统监测：
采用生物灭菌指示剂来检查压力蒸汽灭菌效果是最科学、最可靠的监测方法。由中国预防医学科学院流行病微生物研究所，北京鑫四环消毒技术开发中心联合产销的嗜热脂肪杆菌芽孢（SS1，K31）是国际公认的标准菌株。现制成标准菌片，供检查压力蒸汽灭菌效果检测。
w 菌株特点：
1、 该菌为需氧芽孢杆菌，细菌繁殖体G兰氏染色阴性呈紫色，细菌芽胞孔雀绿着色。其细菌繁殖体对培养基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，表面粗糙呈米黄色。
2、最适生长繁殖温度为56–65℃，培养24h即可形成菌落，37℃下24h看不到菌落。
3、 本生物指示剂载体为高级滤纸片，染菌量为5×105–106cfu/片，封装在小纸袋内，热死亡时间为121℃，3.9min阳性，19min阴性；D10值1.3–1.9min，符合美国药典第十一版规定标准。该菌无毒，热抗稳定，在冰箱内4℃下保存一年抗力无明显下降，在常温（20℃左右）可保存1个月。
w 使用方法：
1、 该芽孢菌片使用时将装有菌片的小纸袋放在被灭菌的物品中心部位（每锅放置菌片数按卫生部规定）。
2、 灭菌后，再无菌操作下取出小纸袋中的菌片， 投放到溴甲酚紫培养液管中。同时将未经灭菌的菌片投入另一管培养基中作对照。
3、 56℃–60℃培养，48h观察结果，对照管为米黄色；若灭菌后菌片培养液颜色不变仍为淡紫色，为阴性（–），表示灭菌彻底；如变黄为阳性（+），表示灭菌不彻底。
w 培养基成分和配制方法：
1、成分：胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、蒸馏水 1000ml、1.6%溴甲酚紫酒精溶液指示剂1ml。
2、配制方法：
（1）1.6g溴甲酚紫溶于98.4ml的96%酒精溶液中摇匀；
（2）把前三种成分溶解后，调解pH7.0-7.2，加入指示剂摇匀；
（3）每管分装5ml，以121℃20min灭菌后，放4℃冰箱内保存，备用。
w 注意事项：
1、防止指示剂中酒精挥发而使溴甲酚紫含量过高（溴甲酚紫含量过高后可抑菌生长）；
2、菌片灭菌后应及时取出培养；
3、禁止菌片接触任何消毒剂及放射源以免影响抗力。
七、化学消毒剂消毒效果监测：
（一）消毒剂有效含量的测试：
1、主要是有效含量不稳定的消毒剂，如过氧 乙酸、含氯消毒剂等应进行含量测试。
2、 化学试剂滴定法较复杂但结果精确；试纸法方便快速，但准确性差。专用测氯试纸——比较准确；复合测试试纸（可同测过氧乙酸、含氯消毒剂）——准确性较差。戊二醛试纸；含碘、臭氧等试纸尚待研究。
（二）化学消毒剂使用溶液污染菌数的检测
1、选好用好中和剂：
2、做到：对应，浓度、比例合适
3、 中和剂选择原则：
①本身对菌无影响
②确能去除杀菌因子
③生成物对菌无影响
④对照完全
★ 试验分组：
① 菌液+药液 培养
②（药+菌液）+中和剂 培养
③ 中和剂+菌液 培养
④（药+中和剂）+菌液 培养
⑤ PBS+菌液 培养
⑥ PBS 培养
⑦ 中和剂 培养
⑧ 培养基 培养
1）方法：
第一步： 用容量为1ml的灭菌吸管，吸取1ml消毒溶液。
第二步：将吸取的1ml样液加入到9ml的稀释液中，这个稀释液的配制成分取决于消毒剂溶液的成分，即在生理盐水溶液中加入合适的中和剂。
浸泡器械用消毒液缸 稀释管 营养琼脂平皿
图1 Kelsey和Maurer提出消毒剂溶液在使用过程中的试验
第三步：
将上述消毒稀释液试管送到实验室，从采样到试验时间不要超过1h，随后用一支50滴/ml量的滴管 (出可用有0.02ml刻度的血清吸管），吸取混合液，在每一个营养琼脂平板表面上（培养基平板表面上已无水分），滴10滴（每滴量为0.02ml），同样滴二个平板。
第四步：
将二个平板分别孵育于二种不同温度的孵箱内；一个放在37℃孵箱内1～2天；另一个平板孵育于20℃左右的室温下3～7天，随后计算二个平板上的菌落数，除以2，即得出每个平板上的平均菌落数。
2）试验结果：
平板培养后有细菌菌落存在，表示消毒溶液中有细菌存在。若一个板上长1～2个菌落，可以忽略，因为消毒剂溶液毕竟是一种化学消毒剂，而不是灭菌剂，因此培养出极少量活菌是属正常。若一个平板上生长5个或5个以上的菌落，则应注意这消毒剂溶液已被污染。从平板上检出菌落数，可以计算出每毫升消毒溶液中存在的细菌数，其计算方法如下：
◆ 由于消毒样液是按1：10稀释，用50滴/ml的滴管滴10滴。如果10滴的消毒剂/稀释液混合液生长了5个菌落，可计算出1ml消毒溶液中存在250个活菌。换句话说，在一个板上滴上10滴，它是1ml的1/5，因此计算如下：
5（一个平板上长菌落总数）×10（用消毒液稀释10倍）×5（在平板滴10滴，只占消毒剂/稀释液混合液的1/5）=250个菌。
5×10×1=100个菌，即每毫升消毒液中存在的细菌数。若一个平板上长20个菌落，则每毫升消毒液中有5×10×5=250个细菌，这样多的细菌，说明此消毒剂溶液已经失效，不能再使用

（见图2）

图2 平板上细菌的污染情况
每滴上各有少数菌落表示不能继续使用
每滴上存在许多菌落表示严重污染
3）消毒剂溶液中长菌的原因:
消毒剂溶液中长菌，常见有下列几种原因：
①容器没有洗净，未经加热消毒处理。
②配制消毒剂溶液时，消毒剂和水量不准确， 使消毒浓度过低不能杀死细菌或抑制细菌。
③消毒剂溶液贮存过久，已经失效。
④由于过多的有机物质在消毒剂溶液中，消耗消毒剂而使消毒剂失效。
⑤在消毒剂溶液中存在着各种抑制消毒剂物质。
八、医疗器械灭菌效果的检测：
采样时间；在灭菌处理后，存放有效期内采样。
（一）常规监测
1、检测方法：缝合针、针头、手术刀片等件医疗器械各5件，分别投入5ml的无菌洗脱液中。注射器则取5副在5ml无菌肉汤中分别抽吸5次。手术钳、镊子等大的医疗器械取2件，用棉拭子反复涂擦采样，将棉拭子投入5ml无菌洗脱液中。振打80次,吸取1ml 接种平皿做活菌计数， 37℃培养48h，计算菌落数。
2、结果判定：平板上无菌生长为灭菌合格。
3、注意事项：若消毒因子为化学消毒剂时，
采样液中应加入相应的中和剂。
（二）无菌检验
1、无菌检验前准备
（1）洗脱液与培养基无菌检验：无菌试验前3天，于需-厌氧培养基中各接种1ml 洗脱液，分别至30~35℃与20~25℃培养72h，应无菌生长。
（2）阳性对照管菌液制备：试验前一天取金黄色葡萄球菌（CMCC 26003）新鲜培养物，接种1环至需-厌氧培养基内，在30~35℃培养16~18h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml备用。取生孢梭菌（CMCC 6494）的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物1环接种于相同培养基内，30~35℃培养16~18h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml备用。取白色念珠菌（CMCC 98001）真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1环，接种于相同培养基内，20~25℃培养24h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml~10cfu/ml备用。
2、无菌操作：
（1）取缝合针、针头、刀片等小件医疗器械5件直 接侵入6管需--厌氧培养管（其中1管作阳性对照）与4管霉菌培养管。培养基用量为15ml/管。
（2）取5副注射器，在5ml洗脱液中反复抽吸5次， 接种需-厌氧培养管（6管，其中1管作阳性对照）与霉菌培养管（共4管）。接种量：1ml注射器为0.5ml，2ml注射器为1ml，5~10ml注射器为2ml，20~50ml注射器为5ml，培养 基用量为2ml以下为15ml/管，接种量5ml为40ml/管。
（3）手术钳、镊子等大件医疗器械取2件用棉拭子涂擦采样，投入5ml无菌洗脱液中，接种于需-厌氧培养管（6管，其中1管作阳性对照）与霉菌培养管（共4管）。接种量为1ml/管，培养基用量为15ml/管。
3、培养：将需-厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于30～35℃培养5天。霉菌培养 管与阴性对照管于20～25℃培养7天。
4、结果判定：阳性对照在24h内应有菌生长，阴性对照无菌生长，需-厌氧培养管及霉菌培养管无菌生长，可判为灭菌合格。
★ 如需-厌氧培养管及霉菌培养管中任何1管显混浊并证明有菌生长，应重新取样，分别复测2次，如各管无菌生长仍可判为灭菌合格。
5、注意事项：
（1）在洁净度100级区域中进行，严格无菌操作。
（2）采样后送检时间不得超过6h，样品保存于4℃，则不超过24h。
（3）如消毒因子为消毒剂，采样液中应加入中和剂。
（4）采样面积，100cm2。
（5）设好阳性、阴性对照。
九、手和皮肤消毒效果检测：
1、采样时间，在消毒后立即采样。
2、采样方法
（1）手，手曲面手指跟到手指端（一只手约30cm2），采样液10ml。
（2）皮肤，5cm×5cm 。采样液10ml。
3、检验方法
取1ml采样液做活菌计数，37℃培养48h。
4、采样结果计算：
平板上菌落数 X 稀释倍数
细菌总数（cfu/cm2）= ---------------------------------
采样面积（cm2）
5、结果判定：
（1）I、II类区域工作人员，细菌总数 ≤5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（2）III类区域工作人员，细菌总数≤10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（3）IV类区域工作人员，细菌总数≤15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
●母婴同室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的工作人员，不得检出沙门氏菌及其他致病菌。
6、注意事项：
（1）采样器材应无菌。
（2）采样液中应含相应的中和剂。
（3）阳性对照的设定问题。
（4）消毒时间要求，外科手消毒3分钟、卫生手消毒1分钟，皮肤消毒5分钟。
十、物体表面消毒效果监测
1、采样时间：消毒处理后采样。
2、采样方法
用5cm×5cm灭菌规格板，采样面积≥100 cm2。门把手等不规则表面直接用棉拭子采样。
3、采样液10ml（含中和剂）。
4、检验方法：同上
5、结果判定：
（1）I、II类区域，细菌总数≤5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（2）III类区域，细菌总数≤10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（3）IV类区域，细菌总数≤15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。母婴同室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的物体表面，不得检出沙门氏菌。
十一、空气消毒效果监测
1、采样时间：消毒后、操作前进行采样。
2、采样方法：
（1）布点：
室内面积≤30 m2，设内、中、外对角线3点，内外点距墙1m；室内面积 >30 m2，设四角及中央5点，四角点距墙1m。
（2）平板暴露法
平板直径9cm、采样高度1.5m，暴露5min。
3、检验方法
平板37℃培养48h。计数菌落数并分离致病菌。
4、平板暴露法结果计算
50000N
细菌总数（cfu/m3）= --------------------
A×T
A为平板面积（cm2）； T 为暴露时间（min）；N 为平均菌落数（cfu）
5、结果判定
（1）I、II类区域，细菌总数≤10cfu/cm3，并未检出致病菌为消毒合格。
（2）III类区域，细菌总数≤200cfu/cm3，并未检出致病菌为消毒合格。
（3）IV类区域，细菌总数≤500cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
6、注意事项：采样前关好门窗，在无人走动的情况下，静止10min 进行采样。
十二、紫外线灯管强度的检测：
1、紫外线是不可见光，紫光≠杀菌。
2、紫外线直射、折射。
3、紫外线穿透力弱。
4、杀菌紫外线为C波段，中心波长2537AO
5、紫外线杀菌剂量：强度 X 时间
6、检测紫外线灯管强度的方法：紫外线强度仪；紫外线强度指示卡
7、紫外线灯管的质量：玻璃无气泡、气线；启动快；不闪动；寿命长；照射强度标准：30W灯管新灯≥90µW/cm2；旧灯≥70µW/cm2
8、紫外线强度测试距灯光垂直100cm照射直接读强度值。
注意：①作好防护：戴眼镜、手套，必要时戴防护面罩。
②紫外灯管开启后稳定5分钟后，读测试数值。
③紫外线强度变化与灯管质量电压，反光罩光洁度等有关。
十三、几点信息和看法：
1、对消毒技术和方法的评价问题：
1）含氯消毒剂的更替；
2）戊二醛和邻苯二甲醛；
3）动态消毒机的效果评价；
4）臭氧消毒的优缺点(氧化作用突出)；
5）空气和表面消毒相结合；
◆消毒是积极的治疗，对任何人都是必不可少的！
◆健康的生命才是最宝贵的！
◆为了保护健康和生命，让我们共同为发展消毒事业而努力！

⑩ 无菌技术基本原则六点

无菌技术基本原则六点为环境清洁、无菌操作、物品管理、无菌物品、取无菌物、无菌操作。

无菌技术是指在执行医疗护理操作的过程中，防止一切微生物侵入机体或传播给他人和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。无菌物品经过物理雹者或化学方法灭菌后，未被污染的物品称无菌物品。

无菌区域经过源枯薯灭菌处理而未被污染的区域，称无菌区域。非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌物品或区域。进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，减少人员走动，以败竖降低室内空气中的尘埃。

无菌技术的使用方法

无菌持物钳（镊）应浸泡在盛有消毒溶液的无菌广口容器内，液面需超过轴节以上2—3cm或镊子二分之一处。容器底部应垫无菌纱布，容器口上加盖，每个容器内，只能放一把无菌持物钳。

经灭菌处理的盛放无菌物品的器具称无菌容器，如无菌盒、贮槽、罐等。无菌容器应每周消毒灭菌一次，无菌包布是用质厚、致密、未脱脂的棉布制成双层包布。其内可存放器械、敷料以及各种技术操作用物，经灭菌处理后备用。将无菌治疗巾铺在清洁、干燥的治疗盘内，使其内面为无菌区，可放置无菌物品，以供治疗和护理操作使用，有效期限不超过4小时。