什么样的方法叫分子生物学方法

① 试述细菌种属鉴定的常用分子生物学方法。

(1)DNA碱基组成的测定：细菌间DNA分子同源程度可以用细菌DNA分子的G+C或A+T摩尔百分比来反映。亲源关系越近的细菌，G+Cmol%越相近。G+Cmol%含量不同的细菌，为不同种细菌；含量相同的可能为不同种的细菌。不同菌属问G+Cmol%范围在25%～75%之间。细菌的G+Cmol%相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。最常用的方法是热变性法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法。
(2)DNA-DNA杂交：DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。目前最常用的是复性速率法，同一菌的复性率为100%；80%～90%的同源为同一种内同一亚种的细菌；60%～70%同源性为同一种内不同亚种的细菌；20%～60%同源则是同一属中的不同菌种。这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误。
(3)165rRNA同源性分析：①rRNA-DNA杂交。变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法。②165rRNA序列测定。rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16SrRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较。
(4)165-235rRNA序列测定：在165和235rRNA的间隔区，各菌种的长度是不一样的，利用包含165和235rRNA部分序列的引物对间隔区进行扩增，分析其长度多态，或结合RFLP技术进行分析来鉴定菌种。
此外限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机引物扩增法(RAPD)等技术常用于菌株间的差异比较。

② 分子生物学技术的分类

目前，常用的分子生物学技术有如下几种 ： PCR- 单链构象多态性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR- SSCP 技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR 扩增后，其产物经变性后可以产生2 条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 中蚂返并，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR- SSCP 分析的主要优点是简易且敏感性较高。但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP 突变检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE 电泳就可能无法检出，在PCR 产物或待测DNA 小于200 bp 时，PCR- SSCP 分析能够检测出70%~ 95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。
Wallace1997 年提出将PCR- SSCP 和异源DNA双链分析（heteroplex analysis,HA) 相结合，称之为SSCP/ HA，部分PCR 产物经变性进行SSCP 分析以了解是否具有突变，其余PCR 产物直接用于电泳，以检出含有突变的异源DNA双链，电泳凝胶经银染，单链DNA所形成的带为橘黄或棕色，而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手段可以单闷迹链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变，是一种经济、迅速的突变检测手段，但无法提供突变位置的信息。
PCR- SSCP 有许多改进技术，如RNA单链构象多态性法（PCR- rSSCP）、双脱氧测序单链片段构象多态分析（PCR- ddF）、限制酶指纹技术(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某类启动子，通过转录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。PCR- ddF 法把PCR 产物转录，将转录物用反转录酶进行Sanger 双脱氧终止测世备序反应，通过观察非变性胶上经解链处理所产生的单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR- REF 法将RFLP 和SSCP 技术优势组合，将PCR 扩增的待测片段用5~ 6 种限制酶依次消化，混合并进行末端标记，最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离，从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变信息。 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段分辨率达一个碱基。当DNA 双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度（Tm) 低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT 碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR 产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE 敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE 方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp 以内可以达到95%。
DGGE 的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使试验无法检出存在于高Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题，可以在一个PCR 引物的5 ' 端设计一段富含GC的尾巴，从而使PCR 扩增产物的一端富含GC 碱基对，保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE 的突变检出率接近100%，但DGGE 只能检测突变是否存在而不能确定突变的位置。
DGGE 方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件，这一过程比较复杂，梯度变性胶的制备需要的设备较昂贵，所以在常规实验室不易实施。 等位基因特异性扩增法（allele- specific amplificarion,ASA) 是基于PCR技术的一种单核苷酸突变检测法，是分析已知碱基替代或微小片段缺失和插入型突变的常规技术。在PCR 的引物设计中，根据已知突变位点性质在引物3 ' 端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补而只扩增突变型或野生型基因。
ASA技术只需一步PCR反应，甚至无需电泳和标记技术。因其快速，重复性强，耗资少，无同位素污染以及高效性等特点，将成为有前途的适应于人群大规模突变筛查的方法。应用该方法最好避免错配碱基为G: T，这种错配可能引发扩增反应。 化学裂解错配碱基法（chemical cleavage mismatch,CCM) 通过化学修饰并切割异源DNA双链中错配碱基，达到检测点突变的目的。其原理是末端标记的DNA片段暴露于可以识别并修饰异源双链中错配碱基的化学试剂中（如错配的胞嘧啶可被羟胺修饰，错配的胸腺嘧啶可被四氧化锇修饰），被修饰的位点随即可被杂氮环已烷等化学物质裂解。DNA修饰裂解后，电泳观察DNA片段长度即可知道突变是否存在。该技术较其他突变检测系统有更多的优越性，可以扫描1~ 2 kb 的大片段DNA并在随后的顺序分析中定位突变位点，其效率可达100%。该手段通常首先对目标DNA和野生型DNA进行PCR 扩增，然后对野生型DNA扩增片段进行末端标记，标记片段作为探针与目标序列复性形成异源双链，用四氧化锇（OsO4） 或羟胺（hydroxylamine) 修饰并用哌啶（piperidine) 切割，聚丙烯酰胺电泳分离不同长度的片段。近年来，有人采用碳化二亚胺作为错配修饰剂，进一步提高了该方法的敏感性。CCM方法最初采用同位素DNA片段，用荧光标记代替同位素后，称之为荧光化学裂解错配碱基法（FCCM），该方法依然比较敏感并且安全，可检出95%~ 100%的错配。化学裂解错配碱基法的不足之处在于工作量大，需要使用有害化学物质作为试验用试剂。

③ 分子生物学实验方法

实验1总DNA提取

生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。

[实验目的]

学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。

[实验原理]

植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。

[实验器材]

1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料

[实验试剂]

1、3×CTABbuffer（pH8.0）

100mMTris

25mMEDTA

1.5MNaCl

3%CTAB

2%β-巯基乙醇

2、TE缓冲液（pH8.0）

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA

3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）

4、95％乙醇

5、液氮

[实验步骤]

1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。

3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。

4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。

6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）

7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。

8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。

9、将粗制品溶于TE缓冲液。

10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。

[注意事项]

1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。

2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

[思考题]

CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？

液氮研磨的原理是什么？

实验二质粒DNA的提取

质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的`双链DNA分子。由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速

而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[实验器材]

1、恒温培养箱

2、恒温摇床

3、台式离心机

4、高压灭菌锅

5、Tip头、Eppendorg管

6、含有目的质粒的E.coli菌株

[实验试剂]

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

3、溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA(pH8.0)

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

6、EcoRI及其缓冲液

7、HindIII及其缓冲液

[实验步骤]

1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。

9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。12、20μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[注意事项]

操作时，避免剧烈震荡。

[思考题]

1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？

2、SDS和NaOH的作用是什么？

[参考文献]

《精编分子生物学实验指南》（第四版）

[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005

实验三总RNA提取

【目的和要求】

1．掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。

2．熟悉RNA纯度及浓度检测方法。

3．了解RNA提取过程中的注意事项。

【实验原理】

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。

【教学内容】

1．总RNA提取的基本原理和常用方法介绍

2．进行动物组织或血液样品总RNA提取。

3．对提取的RNA的进行纯度和浓度检测。

【实验器材和试剂】

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管。

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

细胞裂解液：异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸钠0.5%；β-巯基乙醇0.1mol/L（称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用）

TRIzolRNA抽提试剂、2mol醋酸钠、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。

【实验方法】

（一）异硫氰酸胍法（PLT）

1．取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴

中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2．加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

3．加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4．将混合物转移至1.5mlEp管中，4℃，离心10000r/min,20min.

5．移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置-20℃，30min沉淀RNA.

6．4℃，离心12000r/min，15min.

7．弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10000r/min，10min。

8．弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

9．加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），-70℃保存。

（二）TrizolReagent/总RNA提取试剂

TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。下面介绍由上海美季生物技术有限公司总RNA提取试剂推荐的操作步骤：

1.匀浆处理（Homogenization）

（1）组织中提取总RNA

①植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mlTRIzol。

②动物组织：按10-30mg组织加入1mlTRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。

（2）培养细胞中提取总RNA

①贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1mlTRIzol。

②悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。

（3）血液中提取总RNA

直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。

2．分层（PhaseSeparation）

（1）样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。

④ 分子生物学是指什么

分子生物学是指在分子水平上研究生命现象的科学，从生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程，如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。

生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于：

（1）生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍姿迹规律；

（2）在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小基册游分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围；

（3）分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体搏销内的某一特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。

⑤ 什么是“分子生物学”什么是“基因工程”

什么是分子生物学？

生物学的研究可以说长期以来都是科研的重点，惟其所涉及的方方面面与人类生活紧密相连。本世纪5O年代以前的生物学研究，虽然有些已进人了微观领域，但总的来说，主要是研究生物个体组织、器官、细胞或是亚细胞器这些东西之间的相互关系。50年代中期，随着沃森和克里克揭示出DNA分子的空间结构，生物学才真正开始了其揭开分子水平生命秘密的研究历程。到70年代，重组DNA技术的发展搭伍又给人们提供了研究DNA的强有力的手段，于是分子生物学就逐渐形成了。顾名思义，分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础。从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究；分子生物学在理论和实践中的发展也为基因工程的出现和发展打下了良好的基础，因此可以说基因工程就是分子生物学的工程应用。现在基因工程所展现出的强大生命力和巨大的经济发展潜力完全得益于分子生物学的迅猛发展，而且有证据表明，基因工程的进一步发展仍然要依赖于分子生物学研究的发展。
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什么是基因工程？

随着 DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由 RNA转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，烂咐而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。

如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。

这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。

基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程饥枝纯和微生物工程共同组成了生物工程。

⑥ 请问下微生物测定方法平板计数法与分子生物学方法的区别

平板计数是一种可茄蠢培养活细菌计数的方法，基础有两个，1是平板可培养出目的菌株，2是适当的稀释，可以分出清晰的菌落个数。如果培养的的是混合菌，那就要通过平板上不同的菌落特征去辨别了。 分子方法主要是通过real-time pcr（q-pcr）即实时定量pcr来实现，及根据目的菌的某个基因设计特异性引物尺纳芹，以样本为模板进行pcr，根据产物达到一定量时所用的循陵毕环数多少推算出模板量（细菌数），它可以用标准曲线的方法较为准确的估计出菌数，并且，可以通过特异性引物来界定定量菌的种属。一般现在用taq-man探针法进行q-pcr可以取得较为准确的结果。 参考网址on http://doc.bio1000.com/show-3438.html

⑦ 什么是“分子生物学”什么是“基因工程”

分子医学是新兴学科,它在分子水平上拿雀薯研究人类疾病的发生、发展、诊断和治疗，从本质上掌握疾病的消者规律极其根本性的防治策略。标准的分子生物学技术在遗传学诊断和新的治疗方法中也起着越来越大的作用。
基因工程是人类岁培根据一定的目的和设计,对DNA分子进行体外加工操作,再引入受体生物,以改变后者的某些遗传性状,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术。

⑧ 神经环路研究的分子生物学方法

从毫秒级的分子反应到以年为单位的群体心理学研究，脑相关科学在时间和空间两个坐标上都有很大的跨度。

神经环路（circuit）是指大脑中由神经元相互连接形成的、传递某种特定信息的通路。最简单的神经环路就是大家熟悉的膝跳反射环路：锤击膝盖下方后，感觉信息从肌梭中产生，经过感觉神经元进入脊髓；接着运动信息由motor neuron传出脊髓一直到肌肉，控制股四头肌收缩和二头肌舒张。中枢神经系统的神经环路往往比膝跳反射复杂得多，不仅涉及多个脑区，更具有复杂的连接结构。

不论一个反射有多么复杂，它都由三部分组成：输入（感觉信息），中间处理和输出（行为）。简单如膝跳反射环路，其输入是对膝盖附近的敲击，而输出是肌肉的收缩引起的踢腿行为；复杂如果蝇的求偶行为，其输入是特定的环境、时间、雌果蝇的存在等，而输出是跟随、唱歌、闻嗅等一系列追求雌果蝇的行为。输入和输出往往是容易控制和观察的，而神经系统就像一个黑匣子，我们只知道其输入和输出，却对其工作的机制一无所知。

为了探明神经环路的真相，生物学积累了大量的方法，用以解决下列问题：某神经环路由哪些成分组成？每个组分的功能是什么？这些功能是如何实现的？

要分析神经环路的组分以及它们的功能，也就是从大脑中所有一千亿个神经元中，区分出与某特定功能有关的那些。这就需要我们把神经元的某些特征与神经系统的某些功能对应起来。神经元有什么特征？形态并不足以区分不同的环路（尽管有时外貌特征是有用的，比如中脑黑质的多巴胺能神经元颜色较深）。一般而言，最具有分辨率的特征有两种：①基因表达的时空特征，毕竟这是个体中任何细胞之间产生区别的根本原因；②动作电位发放和突触传递的时空特征，这是神经系统发挥功能的基础。对于基因表达的特性，我们可以使用分子生物学/遗传学的手段探测；而对于动作电位的发放，我们有电生理的方法探测。

接下来，有了特征，我们用什么方法将它们和神经系统的仔脊薯特定功能对应起来呢？为了更形象地解释，我们用果蝇的求偶行为作为例子。一种思路是，①在果蝇求偶的过程中观察其大脑，看看哪些神经元依次进行了活动，从而可以简单地认为这些神经元与求偶相关。这种思路的问题是，如何在活的果蝇中，以高时空分辨率，记录下大脑中每个神经元的活动——这显然是不现实的，但我们可以用各种技巧去接近这个目标，稍后叙述。另一种思路是，②抑制或者增强某些神经元的功能，然后观察果蝇的求偶行为受到了什么样的影响——是增强了（像发情期的泰迪一样对空气交配）还是减弱了（对性感的雌果蝇不屑一顾）。这种方法不需要进行实时记录，只需要轻松地观察行为即可；它的问题在于，如何抑制或者增强特定的一部分神经元的功能。

让我们从第二种思路说起。当我们拔掉网卡，电脑就不能上网了，于是我们认为网卡的功能是连接网络。同样野森地，对大脑也可以用同样的方法研究。二十世纪中叶一位代号H.M.的病人被手术切除了海马，从此很难再形成新的（陈述性）记忆，这极大帮助了科学界对记忆相关环路的理解。然而手术的分辨率是有限的，而且只能切除空间上相近的一部分脑组织。现代生物学既可以利用分子生物学/遗传学方法来永久改变神经元活动（从出生到死亡），也可以利用化学控制、温度控制和光控制来实时操作神经元（数秒至数小时）。

永久地改变神经元活动的方法主要是遗传操作，即减少某些内源性基因的表达和增强某些内源性（或者增加某些外源性）基因的表达。抑制基因表达既可以通过正向遗传学筛选，也可以用反向遗传学的方法，比如同源重组介导的knock out，以及RNAi介导的knock down。增加外源性基因可以通过转基因或者knock in的方法，而过表达内源性基因可以在目标基因上游增加增强子/启动子调控元件。

对神经元的操作有时候需要在特定的时空区段内进行。双表达系统，如Cre/LoxP、Gal4/UAS等提供了模块化的、组织念者特异性的遗传操作手段，从而提高了操作的空间分辨率。病毒注射、光遗传学、化学遗传学等方法提供了暂时改变特定区域基因表达特性的的手段，从而提高了操作的时间分辨率。

接下来再说第一种思路。如何在活体中观察神经元的活动？活动的神经元与不活动的神经元区别在哪？活跃的神经元中有密集的动作电位，大量离子通道的开放和跨膜离子流。电生理技术记录前者，而钙成像技术（GECI，genetically encoded calcium indicators）（最常用GCaMP）记录后者。GEVI记录膜电位的变化，相较GECI有更高的时间分辨率，但荧光强度不足。上述成像技术的另一个问题是，活体厚厚的脑组织对显微镜是巨大的挑战。目前最先进的双光子技术也只能穿透500mm左右的组织并保持分辨率。另外，fMRI记录活跃神经元附近加速的血流，尽管其空间分辨率很低，但作为一种非侵入式的方法在人脑研究中有重要意义。

通过上述两种思路，我们往往会得出形如这样的结果：“A区域和B区域（的xxx神经元）可能与X行为有关，C区域也对该行为有一些影响……”。可是这些区域究竟是如何连接的？区域的边界在哪里？每个区域中究竟有哪些种类的神经元？这些问题在上述两种实验中很难得到完整的解答。这时候就需要解剖学的方法，来对脑进行静态的观察。

如何将特定的细胞标记出来，从而可以将它们和周围细胞区分开来？染色是生物中常用的一种方法。将GFP转进小鼠中，可以标注某些特定细胞类型。MARCM（mosaic analysis with repressible cell marker）技术可以使一簇同种细胞中大部分细胞的荧光色素失活，只留下小部分具有荧光，从而更清晰地观察单个细胞的形态。Photo-convertible/switchable GFP可以用光诱导特异性标注某一个神经元；CaMPARI（calcium-molated photoactivable ratiometric integrator）能特异性标注出活动的神经元，为活体动态记录提供了工具。

除了观察单个细胞的形态，我们还希望了解神经元之间连接的情况。GRASP技术和Functional Mapping能检验两个神经元之间有无连接关系，而基于化学物质或病毒的跨膜tracer则可以找出某个神经元的上游或下游神经元。

上述就是神经环路研究的常用分子生物学方法了。

Bassett, D., Sporns, O. Network neuroscience.  Nat Neurosci   20,  353–364 (2017) doi:10.1038/nn.4502