Ⅰ 苹果酸乳酸发酵
苹果酸乳酸发酵
苹果酸乳酸发酵，很多不是很懂酒的人是不太清楚苹果酸乳是什么东西，其实它是会运用与在葡萄酒上的一种发酵物，它在葡萄酒中产生的作用是非常大的，以下是关于苹果酸乳酸发酵。
苹果酸-乳酸发酵（Malolactic fermentation，MLF）指在乳酸菌作用下将L-苹果酸脱羧基形成 L-乳酸的过程，是葡萄酒生产难以控制的二次发酵过程，主要由酒类酒球菌引起。
在葡萄酒的酿造过程中，苹果酸-乳酸发酵不仅可降低生葡萄酒的酸涩和粗糙感，使之柔和、圆润，而且还提高了葡萄酒的感官质量和生物稳定性，所以，许多优质红葡萄酒甚至一些佐餐红葡萄酒都要进行苹果酸乳酸发酵。
北方地区气候寒冷，苹果酸度较高，酿造出的苹果酒口感较酸涩，需要进行苹果酸乳酸发酵来改善其风味。相反，南方地区苹果酸度较低，有些酿酒师并不提倡进行苹果酸乳酸发酵，所以更多的酿酒师考虑的是苹果酸乳酸发酵对葡萄酒、苹果酒风味的贡献。
MLF所需微生物
乳酸菌LAB在自然界广泛存在，可存在于葡萄的果实和叶梗的表面。LAB为原核微生物，革兰氏染色阳性细菌，其生长繁殖需要从生物氧化中获得能量，当某化合物氧化时便失去电子，为平衡代谢某化合物接受电子而被还原。在苹果酸乳酸转化中，苹果酸是电子供体，而乳酸是电子的受体。LAB也能用丙酮酸作为电子受体，并产生乳酸。
MLF对葡萄酒品质的影响
降酸作用
MLF将氢离子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降0.01g到0.03 g酒石酸酸度/L，pH增加0.3，这一点非常重要，因为如果葡萄酒pH低于3.5，LAB的代谢活性可以升高pH水平，从而使葡萄酒的酸度降低，改善葡萄酒的口感。
提高细菌稳定性
MLF可以提高葡萄酒中细菌的稳定性，MLF发生时由于营养物质的消耗或细菌素的产生其他微生物的生长受到抑制。MLF发生的时间也很重要，如果发生在葡萄酒装瓶之前，就可预防其在瓶中的生长。LAB在瓶中的生长或可引起葡萄酒浑浊、CO2产生，产生多糖导致酒体变黏，或pH提高促使其他腐败微生物的生长等。
风味的改善
葡萄酒经LAB发酵之后，不仅产生乳酸，也产生其他代谢产物，对葡萄酒的风味产生影响。 在有限通风条件下，酒类酒球菌倾向于产生乳酸和乙醇，欲产生更多乳酸则要求更多的通风。
然而，其他LAB在此条件下可能产生醋酸，醋酸本身有刺激性，所产生的醋酸的量非常重要，应避免超出感官检测的阈值。LAB产生的另一个重要的化合物是双乙酰，双乙酰有特征性的奶油风味。
双乙酰的形成取决于前体物质的出现，可由乙醛和乙酰CoA反应形成，或丙酮酸和乙醛反应产生五碳的乙酰乳酸，后者进而再形成四碳的'双乙酰分子和一分子CO2。LAB 发酵过程中可产生的 2，3-丁二醇来自乙偶茵，具有淡淡的苦啤酒的风味，通常在检测阈值以下。
它的形成是一个还原的过程，即电子以乙偶茵和 2，3-丁二醇的形式固定。LAB 发酵过程中还产生乳酸乙酯、丙烯醛等，对葡萄酒的风味产生影响。在含氮丰富的果汁发酵时，葡萄酒中出现奶酪的风味。赖氨酸是酵母的重要营养，但过量添加会导致出现所谓的鼠臭味。一些植物乳杆菌和短乳杆菌代谢酒石酸为醋酸，产生所谓的败坏病，这些是葡萄酒酿造中不希望看到的。
诱发苹果酸-乳酸自然发酵需要采取以下措施：
1、PH值的调整：
当葡萄酒酸度比较高时，也就是在最需要进行苹果酸-乳酸发酵时，这一发酵就越难触发。
在这种条件下，轻度的化学降酸，将PH值提高到3.2，有利于苹果酸-乳酸发酵的触发。
为此，可通过在每升葡萄酒中加入500~1000mg碳酸钙或1000~1500mg碳酸氢钾达到这一目的。
2、温度的控制：
要保证苹果酸-乳酸发酵的触发和顺利进行，必须使葡萄酒的温度稳定在18~20℃。
因此，在红葡萄酒浸渍结束转罐时应尽量避免温度的突然下降，在气温较低的地区或季节还必须对葡萄酒进行升温处理。
最理想的升温方法是利用暖气对环境加热，但如果温度高于22℃，生成的挥发酸含量则较高，从而影响葡萄酒的质量。
3、二氧化硫的处理：
乳酸细菌对游离态二氧化硫较为敏感，结合态二氧化硫也会影响他们的活动，因此，对葡萄酒原料的二氧化硫处理酒成为控制苹果酸-乳酸发酵的必要条件，而且二氧化硫的用量应足以防治乳酸菌病害，但又不能成为在酒精发酵结束后苹果酸-乳酸发酵的限制因素。
为此，葡萄原料的二氧化硫处理最多不能超过100mg/l；
酒精发酵结束后应绝对避免葡萄酒的二氧化硫处理。
4、通风：
通风对乳酸细菌的生长常常是有利的。
因此正在酒精发酵结束后，可对葡萄酒进行适当的通气。
但是，在这一发酵过程中应尽量保证容器处于添满状态，以避免醋酸菌的活动。
利用正在进行苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒接种：
在葡萄酒酒精发酵结束以后，由于没有良好的发育条件和缺乏活泼的乳酸菌，有时苹果酸-乳酸发酵并不能立即进行。
这时可在含有多量苹果酸的葡萄酒中加入25~50%的正在进行或即将结束的苹果酸-乳酸发酵葡萄酒，或用这种葡萄酒换池时的酒脚或过滤的沉淀来接种。
在保持适当温度条件下，将酸度很高的葡萄酒与经过自然发酵酸度减弱等等葡萄酒相混合，这样就可从少量苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒出发，在数星期之内，使大量的葡萄酒降酸。
这一方法的缺点是：首先，必须有适合的葡萄酒；
其次，在接种后葡萄酒中的乳酸菌不一定会顺利繁殖；
若加大接种量，对于这种发放产生苹果酸-乳酸发酵显然是不必要的，但也许是不现实的。
人工诱发苹果酸-乳酸发酵——活性干乳酸菌的使用：
1、苹果酸-乳酸发酵的发酵剂：
景谷县一些即耐酒度、酸度，又首先转化苹果酸的优良乳酸菌株，经过大量繁殖之后作为发酵剂使用，可以使葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵安全可靠。
现在，国外市场已有葡萄酒明串球菌和乳杆菌制成活性乳酸菌发酵剂出售（有兴趣的伙伴八匠鼎松仁建议大家可以咨询查阅一番）。
目前发酵发酵剂的类型可分为液体培养发酵剂、冷冻干燥发酵剂、冷冻浓缩发酵剂和复合发酵剂4中。
他们的特点如下：
①、液体培养发酵剂：
其优点是活性高且适应力强，其缺点是保存时间短，在转移到新培养基之前，只能在冰箱中保存大约两周。
②、冷冻干燥发酵剂：
目前多数苹果酸-乳酸发酵剂大多采用此形式。
他们大量地接种和酒中以达到能触发苹果酸-乳酸发酵的菌群数，而且可以被贮藏在封闭物体或冰箱中，大约一年都不会失活。
有些冻干的发酵剂不用复水和再生酒可直接加到葡萄酒中。
其缺点是这些冻干的菌株不能再恶劣的环境汇总生长繁殖（例如在非常低的PH值、高酒精度、养分缺乏的葡萄酒中）；
③、冷冻浓缩发酵剂：
深度冷冻室最好的保藏发放，在-20℃~-80℃的温度下保藏。
细菌必须保持冷冻状态，一旦融化就必须复活或使用，而不能重新冷冻；
④、复活发酵剂：
有几种乳酸菌组成的发酵剂是有益的。
因为它能较好地适应葡萄酒中的营养条件并对破坏单菌株的噬菌体有抵抗力。
当使用复活菌株发酵剂时，要记住每个起始物培养基和葡萄酒都要选择特定的菌株。
这些发酵剂活活化后接到葡萄酒中，可以成功地触发苹果酸-乳酸发酵。
但是，用活性干乳酸有效地控制苹果酸-乳酸发酵，必须满足一下条件：
①、葡萄酒的总二氧化硫通常不能超过80mg/l；
②、活性干乳酸菌在接种前应在稀释一倍并含有5g/l酵母菌自溶物、PH值4.5的含糖为80g/l的葡萄汁中活化24~72小时，使活性乳酸菌群体数量达到107个/ml；
③、发酵温度必须控制在18~20℃的范围内，PH值3.2以上。
Hansens等人推出了无需活化即可直接接种于葡萄汁或正在进行酒精发酵的葡萄酒中的活性乳酸菌Viniflora LP。
改产品是由纯培养植物乳杆菌经过冷冻获得的活性干乳酸菌。
据研究报道，Viniflora LP在接种后可立即触发苹果酸的分解，并在3~7天内结束，且过程中不影响发酵和不产生挥发酸。
2、人工诱发苹果酸-乳酸发酵条件的控制：
①、葡萄收获季节到来之前，就实行苹果酸-乳酸发酵计划。
葡萄必须再没有腐烂现象的情况下采摘，以减少醋酸菌和野生酵母进入酿酒厂，这样可以保证二氧化硫添加量控制在50mg/l以下；
②、子啊压榨葡萄汁时加入少量或不加二氧化硫，无游离二氧化硫或微量，总二氧化硫控制在20~40mg/l，以消减一些潜在的有害细菌和酵母；
③、一般在酒精发酵快结束（残糖＜50g/l）或酒精发酵完成后即酒精浓度＜14%（体积分数）时接入乳酸菌为最好；
④、PH：3.2~3.5；温度：18~20℃；
⑤、分解L-苹果酸（每天下降0.1~0.2g/l）为好。
3、苹果酸-乳酸发酵结束的控制：
葡萄酒在经过苹果酸-乳酸发酵以后，其中的乳酸菌群体数量并不立即下降，子啊适宜的条件下，他们可以以平衡状态较长期地存在于葡萄酒中，在此期间可作用于残糖、柠檬酸、酒石酸、甘油等葡萄酒成分
引起多种病害和挥发酸含量的升高，因此，当通过纸层析检测到葡萄酒中无苹果酸时，已表明苹果酸-乳酸发酵结束，此时应立即分离转罐，以除去酒脚，同时需要进行20~50mg/l的二氧化硫处理，以充分抑制乳酸菌的活动，保证葡萄酒的生物稳定性。
苹果酸-乳酸酶的新技术：
1、苹果酸-乳酸酶的研究和应用：
葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的实质是乳酸菌中的众多酶类参与生化作用的结果。
根据这一机理，目前已研制出苹果酸-乳酸酶。
则为控制苹果酸-乳酸发酵开辟了新的途径。
研究人员正在努力提高这类酶对葡萄酒固定酶接种葡萄酒的方式促进苹果酸-乳酸发酵。
但现在面临的困难主要是在实践中很难获得大量的苹果酸-乳酸酶，而且在贮藏过程中，即使在-20℃的条件下，其活性也很快地下降，因此，这一方法仍处于实验阶段。
2、固定化乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵的应用：
由于乳酸菌的生长受到葡萄酒的ph、二氧化硫、酒精浓度的抑制，加之发现了静止乳酸菌细胞也可迅速降解苹果酸，不一定非在生长中的乳酸菌发生苹果酸的降解。
所以，近年来日本等过进行了固定化乳酸细胞进行苹果酸-乳酸发酵的研究。
其方法是采用海藻酸盐凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂、交叉菜聚糖加5%皂土等，把乳酸菌细胞（108~109个/ml）包埋于凝胶内，制成固定化乳酸菌细胞。
人喉将固定化乳酸菌装入柱中，串联或其他方法使用即可进行葡萄酒的苹果酸-乳酸连续发酵。
但由于反应器存在易污染杂菌、固定化剂和固定化细胞会脱落于葡萄酒中以及连续发酵细胞的活性会逐渐下降等缺点，尚需进一步完善，才能应用于工业化生产。
Ⅱ 乳酸菌 活化方法
放进适宜的水与葡萄糖与一定的无机盐,在适宜的pH值和温度等条件下,在密闭的绝对干净的容器内进行,应该是这样~~!因为你的冻干保存的乳酸菌只是缺水,有水就能活了.如果我没记错,应该是这样吧....简单一点就低浓度水再水浴加热(温度不能太高)....不过我劝你还是问以下专家.....我的答案可能是错的,请原谅~~~!!!!!!!!!!
Ⅲ 生物选修1知识点 详细
徐州二中2011届生物知识点汇总（选修一模块）
考点一、酶的应用：酵在洗涤等方面的应用；制备和应用固相酶
一、酶在洗涤等方面的应用
1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉,目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶 、淀粉酶、纤维素酶 。其中应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶 和碱性脂肪酶 。碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉、纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更强的去污能力。
酶制剂的特点：能够耐酸、耐碱、忍受表面活性剂和较高的温度，并且通过特殊的化学物质将酶层层包裹，与洗衣粉其他成分隔离。
2、影响酶活性的因素有温度 、酸碱度 和表面活性剂 。 酶不能直接添加到洗衣粉中，因为洗衣粉中的表面活性物质会降低酶的活性。将基因工程生产出的酶用特殊水溶性物质包裹起来，与洗衣粉的其它成分隔离开来。
3、加酶洗衣粉能减少对环境的污染，因为加酶洗衣粉可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，使洗涤剂朝低磷、无磷的方向发展。（普通洗衣粉的化学成分有：表面活性剂、水软化剂、碱剂、漂白粉等成分，有的洗衣粉中还含有增白剂、香精和色素，以及填充剂等。）
普通洗衣粉 加酶洗衣粉
相同点 表面活性剂可以产生泡沫，可以将油脂分子分散开，水软化剂可以分散污垢
不同点 酶可以将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易容于水，从而与纤维分开
4、可在洗涤后比较污物的残留状况，如：已消失、颜色变浅、面积缩小等来判断洗涤效果。
二、制备和应用固相酶
1、固定化酶是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。
原理：将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既易催化反应，又易于回收，可以重复使用。
2、使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
3．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学的方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
4．包埋法法固定化细胞即将微生物细胞包埋在不溶于水的载体中。常用的载体材料有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的，它的优点如下：(1)省去了酶的分离手续.为多酶系统,无须辅因子再生；(2)细胞生长快,而且多,反应快；(3)可以连续发酵,节约了成本,而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞,能一边徘出发酵液,一边进行培养,排除了产物抑制和消耗；(4)保持酶在细胞内的原始状况,增加了酶的稳定,特别是对污染因子的抵抗力增加.
缺点：(1)必须保持菌体的完整,防止菌体自溶,否则,将影响产品纯度；(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解,同时,需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成；(3)细胞膜,壁会阻碍底物渗透和扩散。
类型 优点 不足
直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
固定化酶 既能与反应物接触，又能与产物分离，固定在载体上的酶还可以被反复利用。 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。
固定化细胞 成本低，操作更容易。 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。
应用：1、某一实验小组的同学，欲通过制备固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵实验，实验材料及用具齐全。（1）酵母细胞的固定采用的方法是包埋法。
（2）请完善该实验小组的同学在制备固定化酵母细胞过程的步骤
①配制氯化钙溶液时应用蒸馏水。 ②海藻酸钠溶解应用小火间断加热，边搅拌边加热。③海藻酸钠溶液必须冷却至室温才能加入酵母细胞。④注射器中的海藻酸钠和酵母细胞的混合物应滴入氯化钙溶液中形成凝胶珠。
（3）该实验小组用如图所示的装置来进行葡萄糖发酵
①为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复运用，实验过程中，一定要在无菌条件下进行。
②加入反应液后的操作是关闭活塞1和活塞2。
③装置的长导管起到什么作用？释放CO2，减小反应柱内压力；防止空气进入反应柱。
（4）实验过程中，可能会观察到的现象：有气泡产生、有酒味散发
实验过程中，装置内可能会发生的反应式为：（有氧呼吸、无氧呼吸产生酒精和二氧化碳）
应用：2、麦芽汁可以渗入到由海藻酸钠和啤酒酵母制成的凝胶珠中，啤酒酵母可以利用自身细胞内的一系列酶将可发酵性糖转化成乙醇。下面是利用固定化酵母细胞发酵生产啤酒的实验过程：
步骤1：酵母细胞的活化。称取lg干酵母置于50mL烧杯中，加l0mL蒸馏水，搅拌，静置1h。
步骤2：配制物质的量浓度为0．05mol／L的氯化钙(CaCl2)溶液。
步骤3：配制海藻酸钠溶液。称取0.7g海藻酸钠置于50mI烧杯中，加l0mL蒸馏水，烧杯放在酒精灯上用小火或间断加热。
步骤4：在冷却至常温的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母细胞，充分混合后转入注射器
步骤5：固定化酵母细胞。以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的氯化钙(CaCl2)溶液中形成凝胶珠，让凝胶珠在氯化钙(CaCl2)溶液中浸泡30分钟。
步骤6：固定化酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次。
步骤7：将适量的凝胶珠放人500mL锥形瓶中，加300mL已消毒的麦芽汁，封口于25℃下发酵。
仔细阅读上述过程，回答下列问题：
(1)步骤6用蒸馏水冲洗2～3次的目的是：洗去杂质(氯化钙)和杂菌，防止污染。
(2)发酵产物酒精可用重铬酸钾进行检验，但需在酸性性条件下才呈现灰绿色。
(3)如何检验凝胶珠的质量是否合格？（方法一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。方法二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。）
考点二、生物技术在食品加工中的应用：发酵食品加工的基本方法
一、发酵： 广义：是通过微生物的培养来大量生产各种代谢产物的过程。包括有氧发酵（如醋酸发酵、谷氨酸发酵）和无氧发酵（如酒精发酵）。 狭义：是指微生物的无氧呼吸（包括酒精发酵、乳酸发酵等）。 所以：发酵≠无氧呼吸。
应用： 酿酒、发馒头、面包制作、酒精制造、生产药用酵母片、生产维生素、生产抗菌素等。
二、果酒制作的原理：菌种：酵母菌，单细胞真核生物，异养兼性厌氧型，适宜条件下出芽生殖1、酵母菌的兼性厌氧生活方式：在有氧条件下，有氧呼吸，大量繁殖（无性的出芽生殖）。在无氧条件下，酒精发酵。 繁殖的最适温度：20℃； 酒精发酵的最适温度：18~25℃。
在缺氧、20℃左右（一般将温度控制在18～25℃，最适为20℃）、呈酸性的发酵液中，酵母菌可繁殖并进行酒精发酵。而绝大多数其它微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。2、温度对发酵的影响：酵母菌只能在一定温度下生活。温度低于10℃，酵母菌发育很缓慢。随着温度的升高，繁殖速度加快，20℃时为最佳繁殖温度，此时酵母菌生殖速度快、生活力强。超过35℃，酵母菌生长受到抑制，繁殖速度迅速下降，到40℃酵母菌停止出芽，开始出现死亡。如果想要获得高酒精浓度的发酵液、减少究竟的损耗，必须控制好发酵温度。
3、防止发酵液被污染的措施：榨汁机要洗净并晾干、发酵瓶要洗净并用70%的酒精消毒、装入葡萄汁后要密封
4、葡萄酒呈红色的原因：在发酵的过程中，随着酒精度的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈红色。
三、果醋制作的原理：菌种：醋酸菌，原核生物，异养需氧型，二分裂生殖1、酒变醋的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O （发酵条件：温度适宜、适时通气、控制糖源供应）2、控制发酵条件的作用：①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。3、醋酸菌的来源：菌种可以到当地生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买。也可以从食醋中分离醋酸菌。 果酒果醋的制作流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）四、腐乳制作的原理：菌种：毛霉，真核生物，异养需氧，孢子生殖
1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。2、腐乳制作的实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制（1）毛霉的生长：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在15～18℃，并保持一定的温度。约48小时后，毛霉开始生长，3天后菌丝生长旺盛，5天后豆腐块表面布满菌丝。豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代的腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品的质量。（2）加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。加盐可以析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，在后期的制作过程中不会过早酥烂。同时，盐能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。（3）配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。加酒可以抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味。香辛料可以调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用。3、实验注意事项（1）控制好材料的用量：①用盐腌制时，注意控制盐的用量，盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味。②卤汤中酒的含量应控制在12%左右，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，不足以抑制微生物的生长，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。③所用豆腐含水量在70%左右，含水量过高不易成形。
（2）防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。③越接近瓶口，杂菌污染的可能性越大，因此要随着豆腐层数的加高加盐量要增加，接近瓶品表面的盐要铺的厚一些。
考点三、生物技术在其他方面的应用：蛋白质的提取和分离
一、蛋白质的提取和分离的基本原理和方法
1、实验原理：蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。2、凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子(洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。)（4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。3．缓冲溶液：（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。4．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
二、蛋白质的提取和分离的实验步骤：
1、样品处理 ①红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。②血红蛋白的释放 ：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。（注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。）2、粗分离 ①分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。②透析：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。3、纯化：4、纯度鉴定：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、注意事项1、电泳技术：电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。2、红细胞的洗涤：如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功：由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的：不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。6．G-75：“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义：哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。10．如何检测血红蛋白的分离是否成功：如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关