hplc多肽分析方法

❶ 跪求实验方案急。关于植物小分子多肽的提取分离和分析 最好用到高效液相提取 分析的

多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用。不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。
1 分离方法
采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。
1.1 高效液相色谱（HPLC）
HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。
1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响，并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。
肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱，肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得，并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图，便于鉴定分析。此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。
1.1.2 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。利用GIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定，活性较稳定。Geng等利用HIC柱的低变性特点，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子（EGF）也利用HIC纯化到了，均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能达到这一要求。
1.1.3 分子排阻色谱（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便，如人重组生长激素（hgH）的分离，不同结构、构型的GH在SEC柱上分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体，利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法，此PEC具有半衰期长、作用强的特点。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。
1．1．4离子交换色谱（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。
1．1．5膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分离强蔬水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
1．1．6高效置换色谱（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的。它具有分离组分含量较少成分的特性。利用HPDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素（rHG ）。在研究非毒性交换剂时Jayarama发现硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是对β乳球蛋白A和B的良好置换剂，一般DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜。研究表明置换剂的相对分子质量越低，越易于与固定相结合，因此在分离相对分子质量小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。
1.1.7 灌注层析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。目前市场上可供应的PC固定相种类较多，适合于不同分子量的多肽分离使用。
1.2 亲和层析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等等。对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和，这些配基由天然的，也有根据其结构人工合成的。Patel等人利用一系列亲和柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。
固定金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年来发展起来的一种亲和方法。其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。其中胰岛素样生长因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氢叶还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。
Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法，利用反义DNA表达产生，其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性，如Arg加压素受体复合物，已用此法分离得到。DNA与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。
1.3 毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）--分离分析方法
CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的，其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍。此技术从80年代以来发展迅速，是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。CE根据应用原理不同可分为以下几种；毛细管区带电泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和胶束电动毛细管层析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决定，比传统凝胶电泳更准确。目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发生反应，影响峰形与电泳时间，针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进，如调节电池泳液的PH值，使与硅醇反应的极性基团减少；改进毛细管柱材料的组成，针对多肽性质的不同采取不同的CZE方法研究分离5个含9个氨基酸残基的小肽，确定了小肽分析的基本条件，即在低PH条件下，缓冲液中含有一定浓度的金属离子如Zn2+等，此时分离速度快而且准确。
1．3．2细管等电聚电泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由于不同的蛋白、多肽的等电点（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的电泳槽中，其可在等电点pH条件下聚集沉淀下来，而与其他肽类分离开来。CIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多，主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离，如对rHG不同异构体分离。由于在CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。
1．3. 3毛细管凝胶电泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基于分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。目前，又有一种非交联欢、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽物质的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离，这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较为稳定。
1．3．4胶束电动毛细管层析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如SDS，使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。特别对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质，可使用权含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用，从而利用疏水作用使多肽得到分离。
1．4多肽蛋白质分离工程的系统应用
以上提到的分离多肽的技术在实际应用过程中多相互结合，根据分离多肽性质的不同，采用不同的分离手段。特别是后基因组时代，对于蛋白质组深入的研究，人们对于分离多肽及蛋白质的手段不断改进，综合利用了蛋白质和多肽的各种性质，采用包括前面提到的常规蛋白多肽提取方法，同时利用了高效液相色谱，毛细管电泳，2-D电泳等手段分离得到细胞或组织中尽可能多的蛋白多肽。在蛋白质组学研究中系统应用蛋白和多肽分离鉴定的技术在此研究中即是分离手段也是分析方法之一。特别是以下提到的质谱技术的发展，大大的提高了蛋白多肽类物质的分析鉴定的效率。
2 分析方法
2．1 质谱分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用，特别是在分离纯化后的在线分析中，MS的高敏性、快速性特别适合多肽物质分析鉴定。其中连续流快原子轰击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和电雾离子化质谱（Electrospray Ionization, EIS）是近几年发展起来的新方法。
2．1．1连续流快原子轰击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一种弱离子化技术，可将肽类或小分子量蛋白离子化成MH+或（M-H）形式。主要应用于肽类的分离检测，其具有中等分辨率，精确度大于+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在测定使流动相需加0.5%-10%基质如甘油和高有机溶剂成分，使样品在检测探针处达到敏感化。cf-FAB常与HPLC、CEZ等方法结合使用达分离分析的目的，许多多肽的cf-FAB分析方法已经建立，并得到很好的应用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。证明L-Pro在保持小肽构相稳定性。连接分子方面具有重要意义。
2.1.2 电雾离子化质谱（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可产生多价离子化的蛋白或多肽，允许相对分子质量达1×105蛋白进行分析，分辨率在1500-2000amu。精确度在0.01%左右。EIS更适合相对分子质量大的蛋白质的在线分析，且需要气化或有机溶剂使样品敏感化。利用EIS与HPLC联合分离分析GH和血红蛋白均获成功，其也可与CEZ联合应用。
2.1.3 基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中精确测定测定分子质量的手段，特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定，灵敏度和分辨率均较高。它是目前蛋白质组学研究的必备工具。同时结合液相色谱的联用技术可以高效率的鉴定多肽物质。特别是当各种原理的质谱技术串联应用时，不但可以得到多肽的相对分子质量信息，还可以测定它的序列结构，此项技术将在未来蛋白质组学研究中起到决定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因图谱信号的纯数字化、过度的重叠范围过宽（由于相对分子质量太大）核信号弱等原因，在蛋白、多肽物质的分析中应用一直不多。随着二维、三维以及四维NMR的应用，分子生物学、计算机处理技术的发展，使NMR逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR可用于确定氨基酸序列、定量混合物中的各组分组成含量等分析中。但要应用于蛋白质分析中仍有许多问题需要解决，例如，如何使分子量大的蛋白质有特定的形状而便于定量与定性分析，如何减少数据处理的时间问题等。这些问题多有不少学者在进行研究。虽然在蛋白质分析中应用较少，NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用的，可以克服上述蛋白质分析中的缺点而达到快速准确分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、场解析质谱、IR、UV光谱、CD、圆而色谱、生物鉴定法、放射性同位素标记法及免疫学方法等都已应用于多肽类物质的结果鉴定、分析检测之中。
以上简要的介绍了近几年多肽物质分离、分析的常用方法及最新研究方向。随着科学技术水平的不断发展，会有许多更新的分离分析手段不断涌现，因此这一领域的研究具有广阔的前景。 应用SDS-PAGE显示小分子多肽
SDS-PAGE在分离、鉴定和纯化蛋白质方面有着广泛应用，其有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺与丙烯酰胺比率的增加而减小，比率接近于1：20时，孔径达到最小值。分子量低于10kD的小分子肽类，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离，或是显不出色，或是显带较弱，带型弥散。且分子量越小，效果也越差。
为了能在SDS-PAGE上显示测定小分子量的多肽，通常采取两种方法：一是增加凝胶的浓度和交联度，在制胶时加入一些可以降低聚丙烯酰胺凝胶网限孔径的溶质分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物质；二是选择缓冲液中的拖尾离子的种类和浓度以达到改善多肽的分离效果。
操作步骤
1．电泳缓冲液的配制如下表所示
缓冲液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
阳极缓冲液
阴极缓冲液
胶缓冲液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl调pH
** pH约为8.25

2．丙烯酰胺贮存液的配制
单丙-双丙混合物单丙的百分数双丙的百分数
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯酰胺的总浓度
C：交联度

3．胶的制备，与一般SDS-PAGE相似，按下表配制分离胶和浓缩胶
组 份分离胶
16% T，6%C浓缩胶
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯酰胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯酰胺溶液（ml）
胶缓冲液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%过硫酸铵（μl）
TEMED（μl）
总体积（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．样品缓冲液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巯基乙醇
0.01% Serva blue
多肽样品与样品缓冲液混合沸煮2min（或40℃温浴30min）。
5．将灌胶的玻璃板固定在电泳装置上，用1%琼脂糖封边，倒入阴极缓冲液，依次加样。
6．将电泳装置放入电泳槽内，倒入阳极缓冲液，将正负极与电泳仪相接，恒电压50~60V，待指示剂进入分离胶后，电压可升至70~90V，恒压约3h待指示剂走出凝胶下缘停止电泳。
7．染色、脱色及胶的保存同SDS-PAGE。

❷ HPLC原理是什么

原理：

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别。

被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据就可以以图谱形式打印出来，以便研究人员分析。

(2)hplc多肽分析方法扩展阅读：

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。

高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显着地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

HPLC使用的色谱柱是很细的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm)，所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。

为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进行高压输液。高压、高速是高效液相色谱的特点之一。HPLC使用的高压泵应满足下列条件：

a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10 mL/min)；

b. 能抗溶剂腐蚀；

c. 有较高的输液压力；对一般分离，60×10^5Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×10^5Pa。

⑴往复式柱塞泵

当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。

反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

⑵气动放大泵

其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ）活塞A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 × Pa 的气体就可得到压力为 250×Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。

❸ 请问HPLC是做什么的原理操作方法

HPLC是高效液相色谱，英文全称是High Performance Liquid Chromatography。该方法在化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中被用来做重要的分离分析技术。

用途：高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。

原理：高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析和分离。

操作方法：如下图所示，溶剂贮器中的流动相被泵吸入，经梯度控制器按一定的梯度进行混合然后输出，经测其压力和流量，导入进样阀（器）经保护柱、分离柱后到检测器检测，由数据处理设备处理数据或记录仪记录色谱图，馏分收集器收集馏分，废液瓶收集废液。

(3)hplc多肽分析方法扩展阅读：

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

HPLC根据固定相和流动相的成分分为正相色谱和反向色谱。

正相色谱法

采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8)；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

参考资料：网络-高效液相色谱

❹ 多肽和蛋白质类药物的分析方法

1.1生物检定法
由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构，与二 、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法。生物检定 法 有两个目的，直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大 类。
1.1.1在体分析常规的有胰岛素的小鼠血糖法等，另外还有根据各 类蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各异的方法，如根据IL-8可将大量中性粒细胞从骨中动员出的性质[1] 而建立 的IL-8动员中性粒细胞家兔体内实验。这类方法最直观地反映生物活性，但涉及整体动物 ，费时费力，灵敏度不高，变异较大。
1.1.2离体组织（细胞）分析如NGF刺激鸡背根神经节增长，缩宫素 的大鼠离体子宫法等。 随着分子生物学的发展，许多特异性强，灵敏度高的依赖细胞株被建立，细胞培养已是最常 用的方法。根据蛋白多肽与细胞相互作用的机理不同，具体的操作亦有多种。如细胞增殖法 （Proliferation assays）,快速灵敏,但特异性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),检测系统简单,灵敏而专一; 减少细胞损伤法(Cytopathic effect rection assays ) [2],则是依据具有抗病毒活性的药物如干扰素，保护细胞不受病毒损伤, 方法直观 灵敏, 但 可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细胞数目的增减为量效指标，计数方法有直 接计数法和间接计数法，后者包括MTT法，同位素（3H,14C）掺入法 等。此外，还有根据蛋 白多肽与细胞间接作用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法[3]，结合酶反 应的酶诱 导分解法[4]等。总的说来，细胞培养法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其 不足也显 而易见。首先，生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态；其次 ，样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的交叉反 应，影响了方法的专属性；再者，启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了方法的灵敏度 ；依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性。
1.2免疫学方法
免疫学方法是利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物 ，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常 用的方法有三种。
1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）该法是被测药物（Ag ）,标记药物（多为125I-Ag）与抗体（Ab）的竞争性结合反应，方法的特异性 取决于抗原抗体的亲和力及标记药 物的纯度，与生物检定法相比，有简明，易于控制的优点。
1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）该法中 被测药物依然是Ag，它 先与固定相上的Ab形成Ab∶Ag复合物，再与标记抗体125I-Ab结合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夹心 状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是一灵敏而低变异的方法， 只是对标记抗体的纯度要求很高。
1.2.3酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理与IRMA相 似，只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP来标记，与上 述两法相比，ELISA具有使用寿命长，重复性好，无辐射源的优点，并且已有不少实验证明 ，它与生物检定法具有一定的量效关系[4]及相关性[5]，提示它可部分地 反映药物的生物活性。
免疫学方法的缺点在于它测定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同时测定代谢 物，且具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差；不同来源的抗体与相同的蛋白多肽反 应可能有较大的差别；还可能受到内源物质的干扰。但免疫法毕竟是一种迅速，灵敏，适于批处理的方法，已有数十种蛋白多肽被开发成能满足药物动力学研究的商品药盒。临床 药动学领域，免疫法已逐渐取代生物检定法。
1.3同位素标记示踪法
放射性同位素标记技术是研究蛋白多肽在生物体内处置的一种最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单 而最为常用。标记方法有两种，一是内标法，即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成 体系，该法对生物活性地影响可能较小，但由于制备复杂而限制了其广泛应用；二是外标法 ，常用化学方法如氯胺T或Iodogen法将125I连接于大分子上，因相对简单而被首 选。
同位素法具有简便直观，检测迅速的优点，尤其适用于蛋白多肽药物的组织分布研究，但其 缺点亦显而易见。首先，它不能进行人体药物动力学研究；其次，同位素标记后是否会引起 药物的生物活性及其在生物体内的代谢行为发生变化，一直存在争议．前者可通过调整反应 条件和生物检定法加以改善和验证，基本上可使生物活性无明显变化；后者因药而异则复杂 的多，已有报道认为[6]，放射性标记法可干扰表皮生长因子与细胞的相互作用， 从而导致 其体内清除的紊乱；最后，由于蛋白多肽进入体内会被降解代谢，或与其它蛋白质结合，总 的放射性不能代表药物动力学过程，因此如何鉴别样品的原药，降解物及结合物是该法中需 解决的关键问题，常用的方法有两种。
1.3.1SDS-PAGE法根据药物Mr的大小选择不同浓度的凝胶电 泳，通过控制电流等条件使得原 药与其它产物分开，然后通过切割胶条放射计数或放射自显影的方法，来检测电泳放射性图 谱。该法具有较高的分辨率和灵敏度，但电泳过程中，125I-小肽和游离 125I可能扩散至空白凝胶或电解液中，从而使结果可能偏高。
1.3.2HPLC法高效反相色谱（RHPLC），高效排阻液相色谱（SEHPLC ）[7]，高效离子交换液相色 谱（IEHPLC）分别根据保留时间与蛋白多肽的疏水-亲水性特征，Mr大小，极性的 关系 来分离样品中的物质。它们共同的优点是特异性高，分辨率好，可同时测定原药和降解物， 其中SEHPLC亦可得到结合物的信息，而RHPLC用于蛋白多肽的分离有独特的优越性。但因受 注入样品量的限制，灵敏度，重现性都受影响，且设备昂贵，成本较高。
1.3.3 HPLC-RAD法
高效液相偶联同位素在线检测系统。这种方法将HPLC的高度分析分离行为和同位素的高灵敏度检测结合在一起。使得药物的分析分离更加直观和方便。特别在蛋白质多肽类药物药动学方面体现了其独特的优点。
1.4色谱法
1.4.1HPLC在进行普通药物动力学研究中，HPLC是技术成熟，应用广 泛的分析手段。在蛋 白多肽药物的实验研究或产业化中，HPLC都是主要的分离纯化工具。但鉴于蛋白多肽药物结 构的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio[8]，加压素的八肽拮抗剂（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）[9]可分别直接或经选择性柱反应后,单独 用带荧光检测 器的HPLC进行药动学研究外，HPLC常需进一步改进或与其它更灵敏的检测技术联用方能满足 药动学的需要。除了上述提及的与同位素的联用，还有许多与免疫学方法的联用，如Philli ps[10]采用免疫亲和色谱技术分析人三种不同体液中粒细胞集落刺激因子的浓度； Partilla [11]等认为HPLC与RIA联用可以检测人体液中的神经肽。此外，令人瞩目的还有液 /质在线联用（LC-MS）。
LC-MS将高分离能力，适用范围广泛的色谱分离技术与高灵敏、专属及通用,在研究蛋 白多肽的结构中具有重要价值的质谱法联用起来，成为强有力的分离分析方法。多年来限制 LC-MS技术发展的决定因素是接口问题，由传送带接口（Moving-belt interface），热喷 雾 接口（Thermospray），到最近的电喷雾离子化接口（Electrosptay ionization ESI），联 用技术日趋成熟，尤其适用于生物样品中低浓度（pg/ml）药物及代谢物的测定[12] ，而蛋 白多肽类药物恰有在体内代谢快，浓度低的特点。国外已将用LC-MS于该类药物，药物代 谢 物[13，14]的动力学研究，国内尚处于起步阶段，除了仪器本身价格昂 贵，技术上亦存在 一些问题，如它对样品的纯度要求很高如何将药物从生物体液，尤其是血浆中提取纯化以 减少干扰；如何选择合适的内标以减少系统误差；在将LC-MS用于检测体育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)时发现，糖肽难用于质谱分析，因为在质谱条件下，同样的氨基酸序列可产生 多种不同质量的多糖链，而每条链及整个分子都有可以产生质谱信号，这就大大降低了质谱 信号的专属性。尽管LC-MS在蛋白多肽药物的体内药物代谢动力学研究中还存在一 定的难度，但其作为实用性强，前景好的领域已引起人们的广泛关注。
1.4.2高效毛细管电泳（HPCE）HPCE是离子或荷电粒子以电场为驱动 力，在毛细管中按其 浓度和分配系数不同进行高效，快速分离的新技术，它以高分辨率，高灵敏度，分析时间短 ，样品量少及操作简单等诸多优点而成为蛋白多肽生物分子分离分析的重要手段。在临床 上 ，生物体液中低浓度蛋白多肽的分析面临的问题有：蛋白多肽与毛细管壁的相互作用所引起 的迁移时间的改变，这可以通过涂层CE加以改善；由于毛细管很细，管内容积很小，进样量 的不易控制给实验的重复性带来影响，而且很可能无法对低浓度的样品提供足够的灵敏度。 国外根据样品的性质采用不同的预处理，大体上可分为非特异性和高亲和性两种， 将样品加以浓缩，取得了满意的效果[15]。HPCE在检测上的迅速发展与HPLC已有并 驾齐驱之 势，况且鉴于HPCE在样品微量分析的优越性，已有人在药物动力学研究、体内分析中，将微 透析连续采样与之联用[16]，这在整个药动学研究中都不失为一有希望的方向。 2结语
由以上可知，现代科学技术的发展给蛋白多肽类药物的研究提供了多样的分析手段，但鉴于 该类药物的特殊性，尚无一种方法能完全满足动力学研究的要求。根据人用药物注册国 际协调会议（ICH）对生物药物临床前安全性评价“在科学基础上的灵活性和具体情节个别 处理”的总则，人们通常将几种方法联合应用，互相补充，才能得到比较可靠的结果。