❶ 如何通过分析电泳图谱评判核酸的相对分子质量
如何通过分析电泳图谱评判核酸的相对分子质量:先找到上面的一个相应的酶切位点,这个酶在这个质粒上只有一个识别域。把质粒完全切开后再跑琼脂糖凝胶电泳,配合适当的marker就可以准确的判断质粒的分子量。
❷ 常见的电泳方法
实验室中常见的电泳方法有以下几种:
一、纸电泳
指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。
将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间,样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后,再盖上绝缘密封罩,即可由电泳电源输入直流电压(100V~1000V)进行电泳。
二、醋酸纤维素薄膜电泳
电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
三、凝胶电泳
由区带电泳中派生出的一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式。
凝胶电泳中的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是普通电泳中应用最多的两种形式。
目前,这种办法被广泛用来分析蛋白质和核酸。
四、等电聚焦电泳
1.等电聚焦电泳过程
一种利用有pH值梯度的介质,分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
在一个稳定连续的线性pH梯度的溶液(两性载体电解质)中进行分离,每一种被分离的两性物质都移向与它的等电点相一致的pH位置,在那里不再移动(称为聚焦)。
2.等电聚焦电泳的特点
使用两性载体电解质,在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度;
由于“聚焦效应”,即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面;
电泳速度快;分辨率高;
加入样品的位置可任意选择;
可用于测定蛋白质类物质的等电点;
适用于中、大分子量(如蛋白质、肽类、同工酶等)生物组分的分离分析。
五、等速电泳
采用两种不同浓度的电解质,一种为前导电解质,充满整个毛细管柱;另一种为尾随电解质,置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分,尾随电解质则低于任何样品组分,被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间,在强电场的作用下,各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动,实现分离。
六、双向凝胶电泳(二维电泳)
第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同,将蛋白质进行分离。
第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状,而是呈现为斑点状。
七、免疫电泳
免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳,使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开;然后加入抗体做双相免疫扩散,把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇,在二者比例适当的地方,形成肉眼可见的沉淀弧。
❸ 核酸分析技术有哪些
总的来说包括了核酸的分离、提纯,核酸的扩增,检测,定性与定量分析等。下面以DNA为例说一下相关的概念。
1、DNA的分离提纯就那些试剂,那些步骤,网上一大堆视频的,自己去找吧。
2、扩增一般指的是PCR,需提供引物(引物具有特异性,比如说乙肝病毒基因的引物只能扩增乙肝病毒基因)、酶、底物等,三个流程一个循环:变性、复性、延长。
3、检测一般有紫外分光光度法,电泳分析,杂交分析。
(1)紫外分光光度法:此法的原理涉及到一些光学的知识,可以查询相关书籍以能更好的理解,可以做定量分析,分为单组份分析和多组分分析。
单组份分析有:
1)标准曲线法:用不通浓度的标准溶液,同一条件下测定吸光度A,以吸光度A为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,根据测得的待测样品吸光度,从标准曲线中便可知溶液浓度。
2)标准对照法:标准溶液浓度a,吸光度A,待测样品吸光度B,则根据朗-比定律有待测样品浓度为:B*a/A。
3)吸光系数法:吸光系数K,测得待测样品吸光度A,溶液的厚度d,根据朗-比定律,则待测样品的浓度为:A/(K*d)。
多组分分析没研究过了,自己查查相关资料吧。
(2)电泳分析是根据DNA的分子量和结构不同而在电场中的移动速度不同的原理,电泳的时候需要加MARKER或者已知的基因的片段进行测量。说说MARKER的概念吧,MARKER是由一些列一定梯度的基因片段组成的基因混合物,梯度一般有100bp,200bp,500bp等,MARKER电泳过后便形成很多条距离相等的条带,每两条条带之间的距离为前面提到的梯度值,MARKER用来做标准参考,具有标尺的作用
❹ 核酸电泳方法
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段,是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行,浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶,可用于分离不同分子量的核酸片段。
中文名
核酸电泳
外文名
Nucleic Acid Electrophoresis
学科
分子生物学
概念简介
凝胶电泳操作简便、快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心)所无法分离的核酸片段,是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。
分类
琼脂糖凝胶电泳
1.原理琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶,然后倒入胶模中,凝固后将形成一种固体基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。
将凝胶置电场中,在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移,迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后,大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上,从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。
2.琼脂糖凝胶电泳的仪器及试剂仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。
试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶加样缓冲液。
电泳缓冲液常用TBE(1 000ml中含5.4g Tris,2.75g硼酸,2ml 0.5 mol/L EDTA,pH8.0)。
溴化乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,它可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在电泳过程中随核酸片段迁移,将凝胶置紫外光下,插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光,可清楚显示各核酸片段的迁移。EB见光易分解,应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。由于 EB是一种强的诱变剂并有中度毒性,使用时必须戴手套操作