荧光pcr扩增产物分析方法

❶ 科普讲堂|实时荧光定量PCR检测方法

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。目前，PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。该项技术可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析，提高了普通PCR技术的特异性和准确性，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。

一、常规PCR

利用DNA分子会在体外95°高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时引物会与单链DNA按碱基互补配对原则结合，接着再升高温度到72°C左右，即DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相应的互补链，如此循环往复以达到DNA分子扩增的目的，常规PCR技术无法实现精确定量。

二、实时荧光定量PCR

如要对DNA、RNA样品进行精确定量研究，就需要采用实时荧光定量PCR，根据检测实时荧光PCR产物的方式不同，实时荧光定量PCR主要有DNA结合染料法、基于探针的化学法、淬灭染料引物法等类型。

1.  DNA 结合染料法

原理 ：应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。

应用于核算定量和基因表达验证。

优缺点： 它们的优点是可以对任何双链DNA 进行定量，不需要探针，具有相对高的灵敏度和可靠性，并且成本低，简单易用，缺点是它们能在反应中结合所有的DNA双链，其中包括在PCR过程中产生的引物二聚体或其他非特异产物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，不会与单链DNA结合，并且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。

2.  基于探针的化学法

原理： 应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递检测特异性扩增产物。

应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR。

优缺点： 探针法的鉴别能力远远大于DNA结合染料法，因为它们只与目的产物结合，从不与引物二聚体或其他非特异产物结合，缺点是它的合成价格高。

探针法中最常用的TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，PCR扩增时在加入引物的同时加入探针，探针完整时，荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而检测器可以接收到荧光信号。

3.  淬灭染料引物法

原理： 采用荧光标记引物扩增，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中，依赖荧光能量共振传递。

应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR

优缺点：探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性，还可进行多重PCR扩增，缺点是原料成本价格高

三、实时荧光PCR仪

实时荧光PCR系统包括热循环仪，用于荧光激发的光学系统以及用于收集荧光数据和管理分析的计算机软件，数据通过实时分析软件以图表的形式显示。

❷ 荧光定量PCR的原理以及的结果如何分析

不同探针有些许差别，但原理一样。简单说：就是在探针上加上荧光素，在Taq聚合酶作用下合成带有荧光素探针的片段，再给它激发光，释放一光波，仪器检测并分析。
至于结果：仪器有自动分析功能，会给出一个阈值线。阈值线与荧光曲线的交叉点就是CT值。根据CT值和你使用的试剂盒说明书来判读结果。

❸ 怎样分析荧光定量pcr结果分析

如果有标准曲线,按照标准曲线计算. 一般都是相对量.则用delta delta CT方法来计算.举例如下：对照组基因A的CT值为20,内参（比如βactin)CT值15.实验组基因A CT值18,内参CT值14. 首先算加样量：delta CT=15-14=1.2的1次方是2.也就是说实验组的加样量是对照组的2倍. 基因A:delta CT=20-18=2.2的2次方是4.也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍.但是由于加样量是2倍,所以4处以2=2,最后的相对量是2倍. 几点注意： 1.必须确定扩增的特异性 2.只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同） 3.2的某次方只是理论值,实际扩增效率低于2. 4.最好不用Syber Green

❹ 实时定量PCR的结果是怎样分析的

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算。

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。

3、举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。

4、首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。

5、几点注意：必须确定扩增的特异性，只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同），2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2，最好不用Syber Green。

(4)荧光pcr扩增产物分析方法扩展阅读：

PCR原理：

1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

2、PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

参考资料来源：网络--PCR反应

❺ pcr扩增dna实验报告结果分析是什么

pcr扩增dna实验报告结果分析是延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低。

利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

实验分析

PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

以上内容参考：网络——聚合酶链式反应（ PCR扩增）

❻ pcr扩增产物分析的方法有免疫印迹吗

PCR扩增产物的分析方法微孔板夹心杂交法颜色互补分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打点杂交法微孔板夹心杂交法：该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封 闭过程。另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。DNA的固定在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同来源 的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固 定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方 法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的 NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合 适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使 DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促进DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于300bp， 否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷 酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后， 终浓度为最适固定浓度）。用胶布封好，浸于37℃水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。杂交可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检 测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。显色根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波 长。颜色互补分析法(A)颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型 时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍 可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带 便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显着。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。 用PBS液漂洗。
扩增产物与包被板的结合：PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。室温下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。 ELISA：向结合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-Tween液稀释的HRP-抗FITC抗体，室温下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。将1mgTMB溶于1ml二甲基亚砜中，用50mmol/L醋酸钠-柠檬酸液（Ph4.9）稀释10倍， 向每孔内加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反应在室温下进行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸终止反应。于ELISA计数仪上450nm测定OD值。另外，引物的修饰除用图2-3所示的生物素和FITC外，还可用DNA结合蛋白质的结合位 点和生物素修饰，将DNA结合蛋白质（GCN5或TyrR）包被在微孔板内，与PCR产物结合 后，可加入酶标亲和素进行ELISA检测。PCR-ELISA法可用于PCR产物定量分析。需注 意的是，定量分析时，PCR要在对数期内终止，并需设立已知标准对照。PCR-OLA法(A)研究表明、不同个体中同源DNA片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位 置。已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗 传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。所以，一 般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。寡核苷酸连接试 验（OLA）就是为此目的而设计的。它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序 列。OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。寡核酸杂交 后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节 连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端 修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。连接后，通过固相化的亲和配基使其 固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行 多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。 此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连 接反应，则称之为连接酶链反应。两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位 置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。另外，连接酶所形成的键 是连接产物。该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋 白酶初步处理有核细胞作为检测样品。需指出的是，这里是以放射性标记检测分子为 例的。如图2-6中的地高辛标记分子可避免放射性同位素的缺点，且敏感性相当，更 易于自动化。
寡核苷酸的设计与标记：用于OLA的寡核苷酸一般为20mer，使被检变异核苷酸位于 即将连接的两个寡核苷酸接头的5’端。即位于图2-6中第2步左侧寡核苷酸的3’端。 左侧寡核苷酸是5’标记生物素。右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的 3’-OH相连接。用PNK酶处理很易使其5’或3’标记可以选择其它标记物（如荧光素 等）。OLA反应：向一软质圆底微滴定板内依次加入：3μlPCR扩增DNA产物；1μl剪切的鲑精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混匀室温作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混匀。加入1μl生物素标记探针水溶液（140fmol）和1μl32P探针（1.4fmol），2μlT4连 接(约0.1WeiSS单位，用5×连接缓冲液稀释)。5X连接缓冲液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸与底物反应的连接所需酶液度不同，OLA试验时，一定要小心滴定最适 酶浓度，提高连接温度（50℃）可扩加OLA的特异性。混匀，在100%湿度下于37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混匀，室温下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）链霉亲和素包被的琼脂糖悬液，混匀后室温作用 10min。将一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮过的Whatman4号滤膜置于点样器 上，然后，将微孔板内混合液加入点样孔内，真空抽滤点膜。再用数毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分别依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鲜包好进行放射自显影。打点杂交当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过 程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再 用放射性或非放射性标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变 DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同 位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性 均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作 用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或 法医检验。因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡 核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的 方法。非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度 快。因此，本节仅叙述非放射性标记探针的点杂交与检测情况。
膜的制备：点杂交膜的制备有两种方法，一是将扩增产物直接固定于膜上，每 一个探针制备1张膜。然后，用不同的等位基因特异或某一微生物特 异探针在严格条件下杂交来检测扩增产物的突变类型或鉴定病原 菌；另一种方法是将不同的探针固定到尼龙膜上，然后，用标记的 PCR产物作探针去杂交。这样，根据杂交点的位置即可判断产物序列 变异的种类。显然，前一方法较后一方法繁琐，费时，费力；而后 一方法仅需一次杂交即可判断结果。产物的固定：⑴取1张带正电荷的尼龙膜，按点样器的 大小裁剪膜，并做好标记。⑵将膜浸入水中湿透至少 1min。⑶变性PCR产物：此步可在圆底微孔板或微量离 心管内操作。每点的变性方法为；5～20μl(50～100ng)PCR 产物与100μl变性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混匀，室温作用5min即可。⑷小心将预湿的膜装在点 样器上，注意膜与点样器接触表面不能有任何气泡。 因气泡会使点样点呈环形或月牙形或样品间弥散融 合。膜固定后，每孔内加100μl变性混合液，打开真空泵。⑸抽干变性液后，每孔内再加100μlTE缓冲 液，真空抽滤“洗涤”样品。⑹取下膜，置于厚3mm滤 纸上渍干。重复制备用于其它基因探针的膜时，一定要认真清洗点样器，以免样品间的交叉污染。⑺渍干 的膜于80℃真空干烤1h或于254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的强度下照射使DNA固定在膜上。此时，的膜可直接用 于杂交，也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸内。探针的固定：因寡核苷酸的探针太短，在膜上固定较 困难，即使固定上，也会影响杂交。这就是需要将寡 核苷酸探针用末端转移酶加polydT尾后，UV线照射固 定。因为UV可激活胸腺嘧啶，使其与尼龙膜上的氨基共价结合，使探针间接地牢固地固定在尼龙膜上。这 种加尾固定的探针不影响杂交。但这种杂交对固定探针的要求是，在同一条件下与PCR产物的杂交必须是特 异的。通过选择探针的合适长度，G+C含量或通过改变 探针的固定可达到特异性的要求。这种固定的探针可 用于检测人类基因的突变，也可用来检测病原微生 物。
(1)加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端，在四种脱氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通过改变dT浓度和TdT量 可调节加尾长度，在下述反应条件下，加尾长度可达 400个dT。①向一微量离心管中依次加入：寡核苷酸探 针，100～200pmol;10×TdT缓冲液(1mol/L二甲胂酸钾; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；补水至100μl。 ②混匀后，稍加离心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA终止反应。加尾长度可通过10%聚 丙烯酰胺凝胶电泳监测。(2)点膜：①加尾探针6pmol，用0.3mol/LNaOH室温处理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等体 积6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸三 钠pH7.0)。③将6×SSC预湿的尼龙膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在点样器上。④点样方法同上。(3)固定：①小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的4～6 滤纸上，DNA面朝上。②将滤纸和膜一起置于254nmUV 灯下照射固定，poly(dT)400尾的探针在40mJ/cm2r的 剂下固定效果最好。辐射剂与给定光源对给定面积的 能量释放率（辐照度）和辐照时间有关。一般对一个 固定光源而言，辐照剂量为：辐照剂量（J/cm2）=辐照度（w/m2）×辐照时间(s)其中，J为辐照能量单位；w为辐照通量单位。辐照度 与照射角度有关，与入射角度θ的余弦（cosθ）呈正 相关。③固定后，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中于42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗后可立即用于杂交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾干后室温保存。
探针的固定量与加尾长度均影响杂交结果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探针与等PCR产物（2.33fmol） 杂交，固定6pmol苷酸杂交时，有29.2%的PCR产物与 1.1%的寡核而固定的探针600fmol杂交时，仅有2.2%的产 物与0.8%。用不同加尾长度的等量产物6pmol固定寡核苷酸与（时，仅0.33%233fmol）杂交结果表明， poly(dT)300探针与产物杂交；而有1.3%的探针poly (dT)400时，则与产物杂交。因此，固定的探针加最好 在400个以dT尾上，固定量也至少6pmol。杂交寡核苷酸探针的杂交：每一寡核苷酸探针均有自己的杂交温度和漂 洗条件，主要取决于探针的Tm值。Tm值则受探针长度，G+C含量和杂 交液的盐渡影响。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)来计算Tm 值。在1mol/L盐浓时，杂交温度可比预测的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高杂交温度和降低盐浓度可提高杂交的严格性。漂洗液一般不含 盐，漂洗温度比杂交温度低5℃。一旦确定了探针的杂交与漂洗条 件，可按下述方法进行杂交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中预湿点样膜。⑵置 膜于塑料封口袋中，并加入适量杂交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋内不要有气泡。⑶置于水浴加热摇 动，在杂交温度下预杂交5min。⑷取出塑料袋，剪开一角。加入非 放射性标记物（如生物素-补骨脂素）标记的探针。每毫升杂交中加 入1pmol探针。封口后摇育20～60min。杂交时间不能太长，否则会 引起探针与膜的不可逆结合。⑸从袋中取出膜，室温下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗温度下预热的漂洗 液在合适温度下洗10min。漂洗后的膜可用于显色检测。
反向点杂交：反向点杂交即扩增产物作为相中的探针与固定到膜上 的寡核苷酸杂交。如前述，这种杂交最基本的要求就是在同一条件 下，所有固定探针均与扩增产物特异杂较。为此，主要是认真选择 与设计寡核苷酸探针，使各探针在同一条件下Tm值相近。在同一杂 交特异。一旦确定了合适的杂交和漂洗条件，即可按上述基本程度杂交。只是杂交探针（产物）在加入前应加热变性或用等体积的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA变性。杂交时间（2～4h）要长些。PCR 产物的标记可以用标记引物扩增或在扩增时掺入标记物。杂交的检测不同非放射性标记物的检测原则上基本相同。若为酶标探针则可直接进行显色检测。下面以生物素标记物为例加以说明。酶标亲和素的结合 ⑴漂洗后的膜在缓冲液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中与一定浓度的HRP-标记链霉亲和素在室温作用10min，并轻轻振 荡。⑵用缓冲液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室温下漂 洗5min，并轻轻振荡，将膜上非特异吸附的HRP-链霉亲和素洗掉。显色不同酶标亲和素的显色条件与底物均不同，下面以HRP的显色加以说 明。⑴将上述膜于缓冲液C（100mmol/L柠檬酸钠，pH5.0）中在室温下作 用5min，并轻轻振荡。⑵在缓冲液D中室温下，轻轻振荡10min。此步应避强光。缓冲液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用无水乙醇配制）和19份缓冲液C。⑶在缓冲液E中显色，该液应现用现配。应避强光。缓冲液E：2000 份缓冲液D和1份3%H2O2。显色时间取决于杂交体中含标记物的量； 一般为1～15min即可。杂交阳性呈深蓝紫色。⑷当膜色（信/噪比）合适时，在液C中洗膜1h终止反应，在此过程 中应更换2～3次液体。⑸杂交膜可拍照记录结果，也可封于缓冲液C避光条件下贮存。膜的再利用⑴脱色：将膜置于0.18%Na2SO4液中即可脱掉膜上的颜色。 ⑵去杂交的探针：将膜置于水-0.5%SDS中，65℃加热1h。 ⑶这种处理的膜可再与另一种探针杂交。
问题与对策信号弱：①点膜的产物少-增加点膜量；②杂交时探针浓度低-加大 探针浓度；③杂交漂洗过于严格-增加盐浓度或降低杂交温度；④TMB 液贮存时间过长（TMB液4℃可存2个月）-重新配制。本底信号强：①杂交时探针浓度高-降低探针浓度；②杂交时间长- 缩短杂交时间；③杂交漂洗不严格-降低盐浓度和提高杂交温度；④ 显色时间长-缩短显色时间。杂交膜的高本底着色：①同②；②在缓冲液C中洗膜时间短-延长漂 洗时间（过多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底着色；③同2④；④避 光不严格-显色过程中及显色后要确保杂交膜的避光。阴性对照出现阳性信号：①点样混淆，即把阳性标本点于阴性对照 的位置，重复实验即可纠正；②PCR较物的残留污染，用新配的试剂 重复全部扩增反应。（我自己加进的：Hybond—N+：Hybond-N+是带正电尼龙膜，对在碱性条件下杂交和普通的Southern杂交均有很好的灵敏性，故核酸样品可通过简单的碱处理固定在膜上，而不必在紫外灯下固定，尽管紫外固定的重复性最好。）
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PCR扩增产物的分析方法
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PCR扩增产物的分析方法
微孔板夹心杂交法
颜色互补分析法
PCR-ELISA法
PCR-OLA法
PCR-打点杂交法
微孔板夹心杂交法：
该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的

❼ 荧光定量pcr原理

荧光定量pcr原理如下：

荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。

Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果，但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取，实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。

❽ PCR产物的检测方法有哪些都有什么原理

1.琼脂糖凝胶电泳 同时点分子量marker，根据marker条带判断产物分子量大小，从而大致判断是不是你要的
2.酶切 已知你产物的序列，看上面有什么酶切位点，用一个酶或者两个酶切断，看与理论预测的条带数目和大小是否一致。一般检测有以上两步就行了，如果需要知道确切的需要进行3
3.测序 连接到pMD-18t 载体上，转到大肠杆菌中。拿到公司去测序，测序结果通过gene bank比对看与哪个基因一致，这种方法最准确
4.表达 pcr产物连到真核或者原核表达载体上，适宜条件表达出来以后的蛋白做质谱分析，看与理论产物表达的蛋白是否有一致的片段

❾ 荧光pcr法是什么

一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

技术原理

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中。

在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。